3种食源性致病菌SDS-PMA-mRT-qPCR检测方法建立及其在乳品中的应用OA

本研究利用十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)联合叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)预处理样品后,采用多重实时荧光定量PCR(multiple real-time quantitative polymerase chain reaction,m RTqPCR)方法快速、准确检测乳制品中沙门氏菌、单增李斯特菌和产志贺毒素大肠埃希氏菌3种食源性致病菌。通过对沙门氏菌中的invA基因、单增李斯特菌中的hly基因和产志贺毒素大肠埃希氏菌中的stx基因的保守序列分别设计特异性引物和探针,建立mRT-qPCR反应体系,探讨PMA预处理消除由死菌造成的检测的假阳性结果,并对检测的特异性、检出限、稳定性以及模拟样品中的检测效果进行了研究。结果表明,PMA结合SDS的预处理能有效排除死菌对mRT-qPCR检测结果的干扰,最佳PMA浓度为20μmol/L;建立的mRT-qPCR方法特异性强,在18株非目标菌的干扰下仅对3种目标菌进行特异性扩增;灵敏度高,3种目标菌的检出限均为10^(2) CFU/mL;稳定性好,不同批次内和批次间的重复性检测的变异系数均小于1%;对不同污染乳品的检测结果与国家标准中的培养法一致,检测周期约7 h。本研究建立的SDS-PMA-mRT-qPCR方法可以实现对沙门氏菌、单增李斯特菌和产志贺毒素大肠埃希氏菌的快速检测,为乳品安全提供技术支持。