入胞抗菌肽重组毕赤酵母的构建、表达与活性鉴定OA

本试验旨在构建重组毕赤酵母表达入胞抗菌肽,并验证其纯化产物的体外生物活性,同时构建增强型绿色荧光蛋白(eGFP)融合表达体系,以便于表达监测及后续胞内作用机制研究。将靶向沙门氏菌的CecMd衍生抗菌肽C3M4、C3M4与羊小肠上皮细胞特异性穿透肽CPP偶联形成的入胞抗菌肽C3M4-CPP,以及二者分别与eGFP融合得到的C3M4-eGFP和C3M4-CPP-eGFP共4种基因序列,分别插入pGAPZαA载体后电转化至毕赤酵母SMD1168,构建4株重组毕赤酵母。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质免疫印迹(Western Blot)与二喹啉甲酸(BCA)法对表达的蛋白进行定性与定量分析;目的蛋白经亲和纯化后,进一步评估其体外抑菌活性、稳定性与溶血活性。结果表明:本试验成功构建了重组表达载体与重组毕赤酵母,4种多肽均可成功分泌表达;分泌C3M4和C3M4-CPP的重组菌株发酵72 h时蛋白产量最高,目的蛋白浓度分别为2.91和3.33 g/L;分泌C3M4-eGFP和C3M4-CPP-eGFP的重组菌株分别在发酵96和60 h时蛋白产量最高,目的蛋白浓度分别为4.89和5.23 g/L。所有纯化产物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出抑菌活性;经高温、酸性环境及胃蛋白酶处理后抑菌活性下降幅度较小,而胰蛋白酶处理使其抑菌活性明显降低;4种纯化产物对猪、小鼠、羊、鸡红细胞的溶血活性均较低。综上所述,本研究证实入胞抗菌肽C3M4-CPP可在重组毕赤酵母中高效分泌表达,纯化产物具备良好广谱抗菌活性与稳定性,具备开发为新型抗菌制剂或饲料添加剂的潜力。