BRAF V600E诱导甲状腺乳头状癌基因工程鼠的CD8^(+)T细胞耗竭动态机制研究OA

目的:利用甲状腺过氧化物酶启动子构建并评价BRAF V600E条件性点突变驱动甲状腺乳头状癌(PTC)基因工程小鼠模型,探究肿瘤与免疫系统的相互作用。方法:初步选择BRAF V600E基因条件性点突变小鼠模型,将小鼠分为对照(Control)组和模型(Model)组。Model组小鼠按75 mg/kg剂量腹腔注射他莫昔芬溶液,Control组小鼠腹腔注射等体积玉米油,1次/2 d,均注射5次。分别在给予他莫昔芬12周、16周、20周后,通过超声影像、病理染色和基因型检测等方法,对模型进行综合评价。ELISA检测炎症因子水平;免疫组织化学法检测T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(Tim-3)、颗粒酶B(Gzm B)表达;免疫荧光共定位法检测CD8a、程序性死亡受体1(PD-1)阳性表达;流式细胞术检测肿瘤组织Gzm B^(+)CD8^(+)T细胞水平;Real-time PCR、Western blot测定CD8^(+)T细胞耗竭相关mRNA和蛋白水平,以观察PTC小鼠免疫微环境动态变化趋势。结果:他莫昔芬诱导12周后的小鼠符合PTC超声影像学和病理特征。与Control组相比,他莫昔芬治疗12周组PD-1、PD-L1、Tim-3和Gzm B水平上升,血清IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平上升(P<0.05)。从第12周起,随着造模时间延长,各时间点Model组小鼠Tim-3、PD-1、PD-L1水平逐渐上升,Gzm B、IL-2、IL-6、TNF-α及IFN-γ水平逐渐下降(P<0.05,P<0.01),且与造模时间基本呈负相关,造模20周小鼠各指标差异均有统计学意义(P<0.01)。流式细胞术和免疫荧光验证结果表明,随着造模时间延长,PTC小鼠PD-1^(+)CD8^(+)T细胞逐渐增多,Gzm B^(+)CD8^(+)T细胞逐渐减少(P<0.05,P<0.01),表明PTC小鼠的CD8^(+)T细胞杀伤功能逐渐出现障碍和耗竭,从而形成一种以免疫抑制为主的肿瘤微环境。结论:本研究以基因工程鼠为研究对象,通过对体内原位甲状腺癌的动态研究,发现小鼠造模12周发展成PTC模型,20周后形成以CD8^(+)T细胞耗竭为主的PTC模型,真实地模拟人类PTC免疫学动态演变规律,是整合基础和临床的优势模型,为今后中西药逆转免疫耗竭机制的体内模型提供基础研究和时间节点的参考。