广痛消水提物调控“微循环障碍-炎症介质释放-痛觉敏化”轴减轻大鼠肛门疼痛OA

目的:基于Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)/NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)信号通路探讨广痛消水提物调控“微循环障碍-炎症介质释放-痛觉敏化”轴减轻大鼠肛门疼痛的作用机制。方法:细胞实验:采用CCK-8、Transwell、免疫荧光染色和Western blot法观察广痛消水提物含药血清(Guangtongxiao aqueous extract medicated serum,GTXAEMS)对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)活性、通透性及细胞连接蛋白表达的影响。动物实验:30只SD大鼠随机分为正常组、模型组、广痛消水提物低剂量组(0.73 g·kg^(-1))、广痛消水提物中剂量组(1.45 g·kg^(-1))、广痛消水提物高剂量组(2.90 g·kg^(-1))及硝酸甘油组(0.13 mg·kg^(-1)),每组5只。除正常组外,其余大鼠复制肛门损伤模型,连续干预3 d。通过HE染色观察肛门损伤大鼠肛周组织病理变化;采用ELISA法检测血清、肛周组织和脊髓中白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及一氧化氮(nitric oxide,NO)含量;应用RT-qPCR与Western blot法测定脊髓小胶质细胞M1/M2极化标志蛋白及TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路关键分子的基因和蛋白表达水平。结果:细胞实验:GTXAEMS在实验浓度范围内对正常HUVECs无细胞毒性作用,可上调血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial-cadherin,VE-cadherin)、紧密连接蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)及封闭蛋白5(Claudin 5)表达水平,降低VEGF诱导的HUVECs通透性(P<0.05)。动物实验:HE染色显示,广痛消水提物可显著改善大鼠肛周组织损伤状态。广痛消水提物可升高血清、肛周、脊髓中抗炎因子IL-4、IL-10含量,降低促炎因子IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α含量;增加血清、肛周组织NO含量,降低脊髓NO含量(P<0.05)。广痛消水提物可抑制M1极化标志物诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、CD86表达,促进M2极化标志物精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1)、CD206表达,并下调TLR4、NF-κB、NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)、GSDMD-N蛋白表达水平(P<0.05)。结论:广痛消水提物可能通过降低内皮细胞通透性、改善微循环,减少外周及中枢炎症介质释放,进而激活TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路,缓解中枢敏化,最终减轻大鼠肛门疼痛。