基于胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白-谷胱甘肽过氧化物酶4信号轴探讨电针干预大鼠膝骨关节炎的效果和作用机制OA

目的:基于胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白(cystine/glutamate antiporter,System Xc^(-))-谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)信号轴探讨电针干预大鼠膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)的效果和作用机制。方法:将60只大鼠随机分为空白对照组、模型组、电针干预组、电针联合Ferrostatin-1干预组及电针联合Erastin干预组,每组12只。除空白对照组外,对其余各组大鼠均采用内侧半月板失稳术建立右侧KOA模型。造模成功后第2天,模型组大鼠腹腔注射空白溶媒;电针干预组、电针联合Ferrostatin-1干预组、电针联合Erastin干预组大鼠每日均进行1次电针治疗,并分别注射空白溶媒、Ferrostatin-1溶液、Erastin溶液;空白对照组大鼠不进行任何干预。持续干预21 d后,采用改良Lequesne MG量表评价大鼠右侧膝关节疼痛与功能情况;检测大鼠右侧膝关节灌洗液中白细胞介素(interleukin,IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-6及前列腺素E_(2)(prostaglandin E_(2),PGE_(2))含量;制备右侧膝关节矢状位切片,染色后观察关节软骨组织病理学改变,采用国际骨关节炎研究协会(Osteoarthritis Research Society International,OARSI)骨关节炎组织学评分系统评价关节软骨退变程度;检测大鼠右侧膝关节软骨组织中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)、铁离子水平,以及溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)、GPX4、长链脂酰辅酶A合成酶家族成员4(long-chain acyl-CoA synthetase family member 4,ACSL4)的mRNA和蛋白表达水平。结果:①改良Lequesne MG评分。模型组大鼠改良Lequesne MG评分高于空白对照组、电针干预组、电针联合Ferrostatin-1干预组(P=0.000,P=0.000,P=0.000),电针联合Ferrostatin-1干预组大鼠改良Lequesne MG评分与电针干预组的差异无统计学意义(P=0.264),电针联合Erastin干预组大鼠改良Lequesne MG评分高于电针干预组(P=0.000)。②膝关节灌洗液炎症介质含量。模型组大鼠膝关节灌洗液中IL-1β、TNF-α、IL-6、PGE_(2)含量均高于空白对照组、电针干预组、电针联合Ferrostatin-1干预组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000),电针联合Ferrostatin-1干预组大鼠膝关节灌洗液中IL-1β、TNF-α、IL-6、PGE_(2)含量均低于电针干预组(P=0.000,P=0.002,P=0.000,P=0.002),电针联合Erastin干预组大鼠膝关节灌洗液中IL-1β、TNF-α、IL-6、PGE_(2)含量均高于电针干预组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.001)。③膝关节软骨组织病理改变。番红O-固绿染色结果显示,空白对照组大鼠膝关节软骨表面光滑完整,软骨细胞排列整齐,番红O染色均匀且着色深;模型组大鼠膝关节软骨表面可见缺损,软骨细胞排列紊乱,番红O染色不均且着色浅;与模型组相比,电针干预组及电针联合Ferrostatin-1干预组大鼠膝关节软骨表面缺损程度较轻,软骨细胞排列相对整齐,番红O染色较均匀且着色较深,且电针联合Ferrostatin-1干预组上述表现更优;与电针干预组相比,电针联合Erastin干预组大鼠膝关节软骨表面缺损更为明显,软骨细胞排列更加紊乱,番红O染色更不均匀且着色更浅。④膝关节软骨组织OARSI评分。模型组大鼠膝关节软骨组织OARSI评分高于空白对照组、电针干预组、电针联合Ferrostatin-1干预组(P=0.000,P=0.000,P=0.000),电针联合Ferrostatin-1干预组大鼠膝关节软骨组织OARSI评分低于电针干预组(P=0.020),电针联合Erastin干预组大鼠膝关节软骨组织OARSI评分高于电针干预组(P=0.000)。⑤膝关节软骨组织氧化应激与铁代谢指标。模型组大鼠膝关节软骨组织中MDA、ROS、铁离子水平均高于空白对照组、电针干预组、电针联合Ferrostatin-1干预组(MDA:P=0.000,P=0.000,P=0.000;ROS:P=0.000,P=0.000,P=0.000;铁离子:P=0.000,P=0.000,P=0.000),GSH水平低于空白对照组、电针干预组、电针联合Ferrostatin-1干预组(P=0.000,P=0.000,P=0.000);电针联合Ferrostatin-1干预组大鼠膝关节软骨组织中MDA、ROS、铁离子水平均低于电针干预组(P=0.000,P=0.000,P=0.004),GSH水平高于电针干预组(P=0.004);电针联合Erastin干预组大鼠膝关节软骨组织中MDA、ROS、铁离子水平均高于电针干预组(P=0.000,P=0.000,P=0.000),GSH水平低于电针干预组(P=0.000)。⑥膝关节软骨组织中System Xc^(-)-GPX4信号轴关键基因的mRNA和蛋白表达水平。模型组大鼠膝关节软骨组织中SLC7A11、GPX4的mRNA和蛋白表达水平均低于空白对照组、电针干预组、电针联合Ferrostatin-1干预组(SLC7A11:P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000,P=0.000;GPX4:P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000,P=0.000),ACSL4的mRNA和蛋白表达水平均高于空白对照组、电针干预组、电针联合Ferrostatin-1干预组(P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000,P=0.000);电针联合Ferrostatin-1干预组大鼠膝关节软骨组织中SLC7A11、GPX4的mRNA和蛋白表达水平均高于电针干预组(SLC7A11:P=0.000,P=0.000;GPX4:P=0.000,P=0.000),ACSL4的mRNA和蛋白表达水平均低于电针干预组(P=0.000,P=0.000);电针联合Erastin干预组大鼠膝关节软骨组织中SLC7A11、GPX4的mRNA和蛋白表达水平均低于电针干预组(SLC7A11:P=0.000,P=0.000;GPX4:P=0.000,P=0.000),ACSL4的mRNA和蛋白表达水平均高于电针干预组(P=0.000,P=0.000)。结论:电针干预能够抑制KOA模型大鼠膝关节炎症反应,缓解膝关节疼痛,改善膝关节功能,延缓膝关节软骨组织退变;其作用机制可能为通过激活System Xc^(-)-GPX4信号轴,抑制软骨组织的氧化应激和铁死亡过程。