基于网络药理学与实验验证揭示续香坤宁方改善卵巢储备功能减退机制OA

目的:通过网络药理学结合动物实验,探讨续香坤宁方改善卵巢储备功能减退(DOR)的作用机制。方法:利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、本草组鉴数据库(HERB)、GeneCards数据库、OMIM数据库及GEO数据库筛选续香坤宁方的活性成分及作用靶点,并获取DOR相关疾病靶点,取二者交集作为潜在治疗靶点。利用STRING数据库和Cytoscape 3.9.0软件构建蛋白质-蛋白质互作(PPI)网络并筛选核心靶点,采用R语言进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。动物实验方面,构建雷公藤多苷诱导的DOR大鼠模型,观察动情周期并计算卵巢脏器指数,采用HE染色观察卵巢组织形态学变化,TUNEL染色检测颗粒细胞凋亡;ELISA检测血清抗米勒管激素(AMH)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)及雌二醇(E_(2))水平;生化法检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平;实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)检测卵巢组织中缺氧诱导因子1α(HIF1A)mRNA、信号转导和转录激活因子3(STAT3)mRNA、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)mRNA及Bcl-2相关X蛋白(Bax)mRNA表达,蛋白质印迹法(Western blotting)检测卵巢组织中HIF1A、STAT3、p-STAT3、Bcl-2及Bax蛋白表达水平。结果:网络药理学分析共筛选出续香坤宁方治疗DOR的潜在靶点33个,其中核心靶点包括STAT3、表皮生长因子受体(EGFR)及HIF1A,主要涉及HIF-1、Janus激酶(JAK)-STAT信号通路等。动物实验结果表明,与空白组比较,模型组大鼠动情周期紊乱,卵巢脏器指数降低,卵巢组织中生长卵泡减少、闭锁卵泡增多,颗粒细胞凋亡指数升高,血清AMH、E_(2)水平降低,FSH、LH水平升高,SOD活性降低,MDA含量升高,卵巢组织中HIF1A、STAT3、p-STAT3及Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01)。与模型组比较,西药组动情周期紊乱情况减轻,卵巢组织病理损伤改善,血清AMH、E_(2)水平升高,FSH、LH水平降低,SOD活性升高,MDA含量降低,颗粒细胞凋亡减少,HIF1A、STAT3及p-STAT3蛋白表达降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,续香坤宁方中、高剂量组均可显著改善上述异常改变,表现为动情周期趋于正常,卵巢脏器指数升高,卵巢组织病理损伤减轻,血清激素水平及氧化应激状态改善,颗粒细胞凋亡减少,同时HIF1A、STAT3、Bax的mRNA及蛋白表达下调,Bcl-2 mRNA及蛋白表达上调,p-STAT3蛋白表达下调(P<0.05或P<0.01)。结论:续香坤宁方可改善DOR大鼠卵巢功能,调节血清性激素水平,减轻卵巢组织病理损伤,其作用机制可能与调控STAT3/HIF1A相关信号轴、缓解卵巢局部氧化应激及缺氧损伤、抑制颗粒细胞过度凋亡有关。