坦布苏病毒EvaGreen RT-qPCR通用型检测方法的建立与应用OA

为建立坦布苏病毒(TMUV)各基因型毒株的通用型快速检测方法,通过比对TMUV基因组序列,选择NS5基因为靶标,设计通用检测引物并构建质粒标准品,建立EvaGreen饱和荧光染料一步法实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,检验其效果并检测临床样本。结果显示,所建立检测方法的线性关系良好,相关系数(R^(2))为0.999,熔解温度T_(M)为86℃±1℃;灵敏度较高,检测限为41.8 copies/反应重组质粒;通用性好,可用于检测出各基因型毒株以及引物结合区域存在碱基差异的毒株;特异性好,检测12种常见禽类病毒结果均为阴性。重复性良好,组内和组间变异系数均小于5%。应用该方法对安徽地区送检的128份临床病死禽组织进行检测,TMUV阳性率为16.4%(21/128),与标准NY/T 3233-2018探针法荧光RT-PCR方法检测结果的总符合率为99.2%,且本方法临床检测通用性更好。结果表明建立的TMUV通用型RT-qPCR检测方法,可应用于各基因型TMUV感染的诊断和流行病学监测。