miR-15a/OGT轴水平异常在Ⅱ型糖尿病射血分数保留型心力衰竭小鼠模型中的病理和分子机制研究OA

目的:深入探讨miR-15a/OGT轴水平异常在Ⅱ型糖尿病射血分数保留型心力衰竭小鼠模型中的病理和分子机制。方法:建立高脂肪饮食(持续20周)联合腹腔注射单次低剂量的链脲菌素以及饮用水添加L-NAME(持续15周)诱导的Ⅱ型糖尿病射血分数保留型心力衰竭小鼠模型。20只5~6周龄C57BL/6J雄性小鼠分为对照组和模型组,每组10只小鼠。空腹血糖、葡萄糖耐量试验以及胰岛素耐量试验确证Ⅱ型糖尿病小鼠模型建立成功。HE染色和Masson染色小鼠心脏石蜡组织切片。高效液相色谱质谱联用测定心肌组织代谢组学。分离小鼠心脏原代心肌细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞。双荧光素酶报告基因分析实验分组-1:使用对照组源小鼠心脏原代心肌细胞,分为共转染Mimic NC+OGT 3''-UTR-WT组,共转染miR-15a mimic+OGT 3''-UTR-WT组,共转染Mimic NC和OGT 3''-UTR-MUT组,共转染miR-15a mimic和OGT 3''-UTR-MUT组。细胞实验分组-2:按照小鼠原代细胞来源,分为对照组和模型组。慢病毒介导miR-15a mimic和miR-15a inhibitor的转染。细胞实验分组-3:使用对照组源小鼠心脏原代心肌细胞,分为Control组,Mimic NC组,miR-15a mimic组,Inhibitor NC组和miR-15a inhibitor组。细胞实验分组-4:使用对照组源小鼠心脏原代心肌细胞,分为Control组,TGF-β组和TGF-β+SB431542(TGF-β1抑制剂)组。CCK-8法测定细胞增殖能力。Western blot法测定O-GlcNAc,O-GlcNAc-GSK3β,GSK3β,OGT,OGA,GFAT1,Snail,Collagen IV和TGF-β1的表达水平。结果:与对照组相比,模型组小鼠空腹血糖升高(P<0.05);GTT和ITT结果,从15min~120min,模型组小鼠血糖升高(P<0.05);Masson染色心肌细胞间存在胶原沉积;小鼠心肌组织代谢组学测定结果,小鼠HBP通路代谢(中间)产物尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)水平显著升高(P<0.05);小鼠心肌组织蛋白质O-乙酰葡糖胺化修饰水平升高(P<0.05)。与对照组相比,模型组小鼠心脏来源原代心肌细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞中OGT相对表达水平升高(P<0.05),其中原代心肌细胞OGT相对表达水平升高最为显著(P<0.05);模型组心脏来源原代心肌细胞中miR-15a相对表达水平下调最显著(P<0.01)。与Mimic NC组相比,miR-15a mimic组小鼠原代心肌细胞OGT相对表达水平降低(P<0.05),增殖能力增强(P<0.05),Collagen IV和TGF-β1相对表达水平降低(P<0.05);与Inhibitor NC组相比,miR-15a inhibitor组OGT相对表达水平升高(P<0.05),增殖能力降低(P<0.05),Collagen IV和TGF-β1相对表达水平升高(P<0.05)。与Mimic NC和OGT 3''-UTR-WT共转染组相比,miR-15a mimic和OGT 3''-UTR-WT共转染组荧光素酶报告基因表达水平降低(P<0.05)。与Control组相比,TGF-β组GFAT1、Snail、O-GlcNAc-GSK3β相对表达水平升高(P<0.05);与TGF-β组相比,TGF-β+SB431542组GFAT1、Snail、O-GlcNAc-GSK3β相对表达水平降低(P<0.05)。结论:Ⅱ型糖尿病射血分数保留型心力衰竭小鼠模型原代心肌细胞中miR-15a/OGT轴水平异常,导致蛋白质O-GlcNAc水平升高,参与心力衰竭的病理生理机制。