生慧汤调控cAMP/PKA/CREB/BDNF信号通路改善阿尔茨海默病斑马鱼模型突触可塑性和认知功能障碍的作用机制OA

目的:探讨生慧汤对氯化铝(AlCl3)诱导的阿尔茨海默病(AD)斑马鱼模型学习记忆障碍的改善作用及分子机制,重点阐明其对环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶(PKA)/cAMP反应元件结合蛋白(CREB)/脑源性神经营养因子(BDNF)信号通路及突触可塑性的调控效应。方法:6~7月龄野生型AB系斑马鱼150尾,随机数字表法分成空白组,模型组,生慧汤低、中、高剂量组(0.74、1.48、2.96 g·kg^(-1))和多奈哌齐组(0.01 g·kg^(-1)),每组25尾。采用慢性AlCl3浸泡法(0.0002 g·kg^(-1))建立AD模型,持续30 d。T迷宫评估斑马鱼空间学习记忆;新物体识别检测斑马鱼识别记忆;新缸潜水实验评估斑马鱼焦虑样行为;苏木素-伊红(HE)染色观察端脑神经元形态;Fluoro-Jade B(FJB)染色检测端脑变性神经元;透射电镜观察端脑突触超微结构;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测脑组织cAMP含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测脑组织中PKA、CREB、p-CREB、BDNF、突触素(SYN)和突触后密度蛋白-95(PSD-95)的蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测PKA、CREB、BDNF及凋亡相关基因B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和胱天蛋白酶-3(Caspase-3)的mRNA水平。结果:与空白组比较,模型组首次进入富集营养区(EC区)潜伏期显著延长(P<0.01),穿越EC区次数显著减少(P<0.01);新物体识别指数显著降低(P<0.01)。首次进入顶部区域潜伏期显著增加(P<0.01),顶部区域停留时间显著减少(P<0.01)。端脑变性神经元数量显著增加(P<0.01),神经元排列紊乱,胞体萎缩,核固缩及胞质空泡化;线粒体嵴膜断裂,肿胀及空泡化;凋亡相关基因Bcl-2水平显著减少(P<0.01),Bax和Caspase-3水平显著增加(P<0.01)。突触前膜囊泡数量减少,突触间隙增宽,突触后致密区变薄,且突触相关蛋白SYN和PSD-95表达显著减少(P<0.01)。脑组织cAMP含量显著减少(P<0.01),PKA、CREB、p-CREB和BDNF蛋白表达水平显著减少(P<0.01),PKA、CREB和BDNF的mRNA表达水平显著下调(P<0.01)。与模型组比较,生慧汤中、高剂量组和多奈哌齐组学习记忆和焦虑样行为改善,表现为首次进入EC潜伏期显著缩短(P<0.01),穿越EC区次数显著增加(P<0.01);新物体识别指数显著升高(P<0.01);首次进入顶部区域时间缩短,顶部区域停留时间显著增加(P<0.01);各给药组端脑变性神经元数量均显著减少(P<0.01);神经元形态改善,排列较整齐,核固缩和空泡化减少;线粒体嵴膜相对完整,空泡化减少;生慧汤中、高剂量组Bcl-2 mRNA水平显著增加(P<0.01),Bax和Caspase-3 mRNA表达明显减少(P<0.05,P<0.01)。各给药组突触囊泡数目增多,突触间隙变窄,突触后致密区变厚;突触相关蛋白SYN和PSD-95表达增强。生慧汤各剂量组cAMP含量显著增加(P<0.01),PKA和CREB mRNA水平显著上调(P<0.01),生慧汤中、高剂量组BDNF基因水平明显上调(P<0.05,P<0.01),多奈哌齐组PKA和CREB mRNA水平显著上调(P<0.01);生慧汤中、高剂量组PKA、CREB、p-CREB和BDNF蛋白表达水平均显著升高(P<0.01),生慧汤低剂量组p-CREB和BDNF蛋白表达水平显著增加(P<0.01),多奈哌齐组CREB、p-CREB和BDNF蛋白表达显著增强(P<0.01)。结论:生慧汤可以通过激活cAMP/PKA/CREB/BDNF信号通路,改善突触可塑性,抑制神经元凋亡,缓解AlCl3诱导的AD斑马鱼的学习记忆障碍和焦虑样行为。