基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨清解扶正颗粒调控糖酵解抑制大肠癌转移的作用机制OA

目的 研究清解扶正颗粒(QFG)通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控糖酵解抑制大肠癌转移的作用机制.方法 (1)细胞实验:① 常规培养HCT116细胞,按照随机数字表法分为0 mg/mL组、0.5 mg/mL组、1.0 mg/mL组、1.5 mg/mL组,采用不同浓度QFG分别干预24 h和48 h,通过CCK-8法检测细胞存活率,qRT-PCR检测各组细胞PKM2 mRNA转录水平,从而筛选出QFG最佳干预参数为1.0 mg/mL、48 h.② 在此基础上,按照随机数字表法分为空白组和QFG组,空白组不加任何干预药物,QFG组予以1.0 mg/mL的QFG溶液干预48 h,采用细胞划痕实验检测迁移能力、Transwell实验检测侵袭能力、生化法检测乳酸含量、流式细胞术联合2-NBDG荧光探针检测细胞葡萄糖摄取能力,同时通过Western blot检测PKM2蛋白相对表达量.③ 构建PKM2过表达载体,转染至HCT116细胞,分为0 mg/mL组、过表达空载(NC)组、PKM2过表达(PKM2 OE)组,采用qRT-PCR和Western blot分别检测PKM2 mRNA转录水平和蛋白相对表达量,以验证转染结果.④ 将转染成功的细胞分为NC组、PKM2 OE组、NC+QFG组和PKM2 OE+QFG组,通过CCK-8法检测细胞存活率、细胞划痕实验检测迁移、Transwell实验检测侵袭、流式细胞术联合2-NBDG荧光探针检测细胞葡萄糖摄取,通过Western blot检测PKM2蛋白相对表达量.(2)动物实验:采用皮下接种结肠癌细胞HCT116构建裸鼠皮下移植瘤模型,7 d后裸鼠腋下见明显质硬肿瘤生长,即为造模成功.将造模成功的裸鼠按照随机数字表法分为模型组及低、中、高剂量组,每组6只,低、中、高剂量组分别按0.5、1.0、2.0 g/(kg·d)给予QFG灌胃,模型组给予生理盐水灌胃,灌胃体积均为10 mL/kg,每日1次,连续干预15 d.干预结束后对小鼠进行称重,2 d 1次,持续15 d,在灌胃第3、6、9、12、15天测量瘤体长短径,计算瘤体体积.随后取肿瘤组织进行HE染色,观察组织病理结构.采用Western blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白(PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、HIF1-α、Myc)表达量,免疫组化检测肿瘤组织糖酵解相关蛋白(PKM2、MCT1、MCT4、GLUT1)表达量.结果 (1)细胞实验:① QFG可呈时间、剂量依赖性抑制细胞增殖.干预24 h时,与0 mg/mL组 比 较,1.0、1.5 mg/mL组细胞存活率显著下降(P＜0.05),0.5、1.0、1.5 mg/mL组PKM2 mRNA转录水平均上调(P＜0.05);干预48 h时,与0 mg/mL组比较,1.0、1.5 mg/mL组细胞存活率与PKM2 mRNA转录水平同步降低(P＜0.05),0.5 mg/mL组PKM2 mRNA变化差异无统计学意义(P＞0.05).综合增殖抑制与PKM2转录水平结果,且规避1.5 mg/mL高浓度造成的严重细胞损伤,选定1.0 mg/mL、干预48 h作为后续实验条件.② 与空白组比较,QFG组细胞迁移和侵袭能力降低(P＜0.05),乳酸含量和荧光强度均降低(P＜0.05),PKM2蛋白相对表达量升高(P＜0.05).③ PKM2 OE组PKM2 mRNA转录水平和蛋白相对表达量均较0 mg/mL组和NC组明显升高(P＜0.05),表明细胞转染成功;④ 与NC组比较,PKM2 OE组细胞迁移、侵袭、存活率、荧光强度均升高(P＜0.05),NC+QFG组上述指标均降低(P＜0.05);与PKM2 OE组比较,PKM2 OE+QFG组上述指标也降低(P＜0.05).与NC组相比,PKM2 OE组PKM2蛋白相对表达量升高(P＜0.05);NC+QFG组PKM2蛋白相对表达量亦高于NC组(P＜0.05),但低于PKM2 OE组(P＜0.05);与PKM2 OE组比较,PKM2 OE+QFG组PKM2蛋白相对表达量变化差异无统计学意义(P＞0.05).(2)动物实验:与模型组比较,低、中、高剂量组瘤体体积、瘤体重量均降低(P＜0.05);模型组细胞形态和组织结构排列较为规则,低、中、高剂量组细胞形态不规则,组织结构较为紊乱,且有不同程度的核大深染,部分还出现组织出血;与模型组比较,低剂量组PKM2、p-Akt蛋白相对表达量均升高(P＜0.05),Akt蛋白相对表达量降低(P＜0.05),中剂量组p-PI3K、HIF1-α蛋白相对表达量均降低(P＜0.05),PKM2蛋白相对表达量升高(P＜0.05),高剂量组p-Akt、mTOR、HIF1-α蛋白相对表达量均降低(P＜0.05);与模型组比较,低、中、高剂量组瘤体中PKM2阳性表达均升高(P＜0.05),MCT1、MCT4、GLUT1阳性表达均降低(P＜0.05).结论 清解扶正颗粒可通过PI3K/Akt/mTOR信号通路以及调控PKM2功能状态抑制大肠癌细胞异常糖酵解与侵袭转移.