乳酸介导的组蛋白乳酸化对骨髓间充质干细胞衰老及成骨分化的影响OA

目的探究乳酸生成及组蛋白乳酸化在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)衰老过程中的表达变化,以及乳酸代谢对衰老BMSCs成骨分化的影响,为衰老相关骨质疏松及骨修复障碍的代谢调控干预提供实验基础。方法获得单位实验动物伦理委员会审批,采用全骨髓贴壁法提取小鼠BMSCs,经流式细胞术鉴定表面标志物(CD29、CD90、CD11b、CD45)。建立不同浓度依托泊苷(0、5、10、15、20μmol/L)诱导BMSCs衰老的细胞模型,通过qRT-PCR和Western blot检测衰老相关指标(p53、p21、p16)基因和蛋白的表达水平,结合CCK-8和SA-β-gal实验确定最适诱导浓度。将BMSCs分为对照组和依托泊苷诱导衰老组,检测乳酸生成水平和组蛋白乳酸化相关酶(Ldha、Ep300、Sirt2)的表达;采用Western blot检测泛赖氨酸乳酸化(Pan-Kla)及组蛋白H3第18位赖氨酸乳酸化(H3K18la)的变化。抑制乳酸生成实验中,将BMSCs分为对照组、衰老组(10μmol/L依托泊苷处理)、衰老+GNE-140组(10μmol/L依托泊苷+1μmol/L GNE-140处理),通过qRT-PCR、Western blot及SA-β-gal染色评估抑制乳酸生成对细胞衰老表型的影响。成骨分化实验中,设置对照组、衰老组(10μmol/L依托泊苷处理)、衰老+5 mmol/L乳酸钠组、衰老+10 mmol/L乳酸钠组,采用Western blot检测Pan-Kla和H3K18la的水平,qRT-PCR检测Runt相关转录因子2(Runx2)、成骨特异性转录因子Sp7(Sp7)、碱性磷酸酶(Alpl)mRNA表达;Western blot检测Ⅰ型胶原(COL1)、RUNX2、成骨特异性转录因子(OSX)、骨钙素(OCN)蛋白表达;茜素红染色观察BMSCs形成矿化结节的情况。结果流式细胞术显示,BMSCs高度表达CD29(97.3%)和CD90(95.7%)。依托泊苷以10μmol/L为最适浓度,通过激活p53-p21通路诱导衰老。与对照组相比,衰老BMSCs中乳酸生成减少,Ldha、Ep300 mRNA表达下降(P<0.001),Sirt2 mRNA上调(P<0.01),Pan-Kla和H3K18la修饰水平下调(P<0.001)。使用GNE-140抑制乳酸生成后,p53、p21表达及SA-β-gal阳性细胞比例进一步升高(P<0.01)。成骨分化实验中,衰老BMSCs的Runx2、Sp7、Alpl mRNA与COL1、RUNX2、OSX、OCN蛋白表达水平及矿化结节形成能力均下降(P<0.05);外源性补充5 mmol/L和10 mmol/L乳酸钠可增加泛乳酸化和组蛋白乳酸化水平,并改善衰老BMSCs的成骨分化能力,促进矿化结节形成。结论BMSCs衰老伴随着乳酸生成减少和组蛋白乳酸化修饰水平降低;外源性补充乳酸钠可改善衰老BMSCs的成骨分化障碍。