EZH2基因敲除PK-15细胞系的构建及其对PCV2复制及主要免疫因子表达的影响OA

【目的】构建稳定的Zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)基因敲除猪肾细胞系(PK-15),并分析EZH2基因缺失对PK-15细胞增殖、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)复制及宿主先天性免疫应答的影响。【方法】基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对猪EZH2基因外显子1~3区设计sgRNA,将其与Cas9 mRNA共转染到PK-15细胞中,筛选单克隆细胞并经Sanger测序验证,获得EZH2基因敲除细胞系。检测敲除细胞的EZH2蛋白表达和细胞活力后,将敲除细胞系接种PCV248 h,分别用实时荧光定量PCR和Western blotting检测PCV2 Cap基因和蛋白表达量,并检测EZH2基因敲除对PCV2感染引起的干扰素(IFN)及干扰素刺激基因的表达变化。【结果】测序证实sgRNA 3靶位点存在碱基缺失,Western blotting验证EZH2蛋白完全不表达,成功构建EZH2基因敲除PK-15细胞系。与野生型细胞相比,EZH2基因敲除显著促进了PK-15细胞增殖(P<0.05);PCV2感染后,敲除细胞中PCV2 Cap基因及蛋白表达量显著降低,IFN-β和IFIT1基因表达量显著升高(P<0.05),而IFN-α、OAS1、PKR和ISG15基因表达量无显著变化(P>0.05)。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建EZH2基因敲除PK-15细胞系,证实EZH2基因缺失可增强细胞增殖能力,且PCV2感染后上调IFN-β和IFIT1基因表达并显著抑制病毒复制。研究结果为解析PCV2致病机制及筛选宿主抗病毒靶点提供了新的试验依据。