鸡ELAVL1基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用OA

【目的】建立鸡胚胎致死异常视觉蛋白1基因(ELAVL1)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为研究鸡ELAVL1基因在肿瘤性疾病发生发展中的作用提供技术支持。【方法】根据鸡ELAVL1基因序列设计特异性荧光定量PCR引物,以pMD19-T-ELAVL1质粒为模板,优化引物浓度和退火温度,进行实时荧光定量PCR扩增,建立鸡ELAVL1基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。以pMD19-T-ELAVL1质粒为标准品,进行实时荧光定量PCR扩增,建立标准曲线,检测该方法的特异性、敏感性和重复性。应用该方法检测鸡ELAVL1基因在不同组织中的转录水平及其在鸡淋巴瘤细胞MSB1、鸡成纤维细胞DT40、鸡肝癌细胞LMH和鸡成纤维细胞DF1中的差异表达情况。【结果】鸡ELAVL1基因实时荧光定量PCR检测方法最佳引物浓度为0.2μmol/L,最佳退火温度为60℃;建立的标准曲线循环阈值(Ct)与模板浓度(1.1×10^(3)~1.1×10^(8)拷贝/μL)有良好的线性关系(R^(2)=0.993),扩增效率为109.7%。建立的鸡ELAVL1基因实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性;对重组质粒的检测下限为1.1×10^(1)拷贝/μL,灵敏度是普通PCR的100倍;批内和批间变异系数分别为0.44%~1.92%和0.32%~0.57%,重复性良好。ELAVL1基因在鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺和法氏囊中均有表达,在脾脏中表达水平最高,在肺脏中表达水平最低;在鸡淋巴瘤细胞MSB1、鸡成纤维细胞DT40和鸡肝癌细胞LMH中的表达量显著或极显著高于鸡成纤维细胞DF-1。【结论】建立了鸡ELAVL1基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,该方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性。