牛病毒性腹泻病毒E0蛋白纳米抗体文库构建及筛选OA

【目的】建立针对牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)E0蛋白的纳米抗体(即重链抗体重链可变区(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody,VHH))噬菌体展示文库,从中筛选特异性结合E0蛋白的纳米抗体。【方法】将重组质粒pET-28a-E0转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导表达与纯化,获得高浓度E0重组蛋白;以该重组蛋白为免疫原对双峰驼进行多次免疫,检测到双峰驼血清中产生高效价抗E0蛋白抗体后,采集其外周血淋巴细胞并提取总RNA,通过RT-PCR扩增VHH基因并与噬菌体载体pComb3XTT连接,构建纳米抗体噬菌体展示文库,以E0重组蛋白为靶蛋白进行多轮生物淘选,逐步富集能特异性结合E0蛋白的噬菌体克隆。利用ELISA对淘选获得的克隆进行筛选,对筛选后的噬菌体克隆进行测序分析。【结果】成功表达并纯化出E0重组蛋白,经4次免疫后,双峰驼血清中E0蛋白抗体效价为1∶64000;提取免疫后双峰驼外周血淋巴细胞的RNA,RT-PCR扩增VHH基因片段,琼脂糖凝胶电泳结果显示,获得了与预期大小相符的核酸片段(约500 bp),并连接至pComb3XTT,成功构建总库容量为2.2×10^(9) CFU、插入效率≥95%、序列多样性丰富的纳米抗体噬菌体展示文库。筛选出49株能特异性结合E0蛋白的纳米抗体。对这49株纳米抗体进行序列分析发现,其中48株具备典型的纳米抗体结构特征,包含完整的框架区(framework region,FR)FR1~FR4及互补决定区(complementarity determining region,CDR)CDR1~CDR3,且各株纳米抗体的CDR3氨基酸序列呈现出较高的多样性,提示它们可能通过独特的空间构象实现对E0蛋白不同表位的特异性识别。【结论】本研究成功构建了针对BVDV E0蛋白的纳米抗体噬菌体展示文库,筛选后获得多株结合E0蛋白的噬菌体克隆,测序分析结果表明,各目标序列均具备典型的纳米抗体结构特征,为后续开发便捷高效的BVDV快速诊断技术、设计精准靶向的抗病毒制剂奠定了重要基础,同时也为深入解析BVDV的致病机制与免疫逃逸策略提供了新的分子工具。