胸膜肺炎放线杆菌铁调节蛋白AfrA的鉴定及免疫特性分析OA

【目的】评价胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)铁调节蛋白AfrA的免疫保护效果,为筛选有效的APP亚单位疫苗组分提供参考。【方法】鉴定AfrA基因在APP血清1~12型中的分布,解析AfrA蛋白结构;利用原核表达系统表达和纯化AfrA蛋白,免疫兔制备高免血清,在富铁和限铁培养条件下通过Western blotting鉴定AfrA蛋白在APP血清1~12型中的表达水平;通过APP血清7型对小鼠进行攻毒,测定其半数致死量(LD50);以AfrA重组蛋白作为免疫原免疫小鼠,利用ELISA测定AfrA蛋白血清抗体水平,同时通过APP血清7型攻毒测定其对小鼠的免疫保护效果。【结果】在测定的APP血清1~12型中,AfrA基因存在于除血清10型外的其他血清型中,且AfrA氨基酸序列相似性在99.8%以上,AfrA蛋白呈现典型桶状跨膜蛋白结构;经SDSPAGE验证AfrA蛋白成功表达并对其进行纯化,制备获得兔抗AfrA蛋白高免血清,抗体效价为1∶102400。Western blotting结果显示,除血清10型未检测到AfrA蛋白表达外,其他血清型在限铁培养条件下AfrA蛋白表达均显著高于富铁条件(P<0.05)。ELISA检测结果显示,AfrA重组蛋白免疫小鼠后可诱导产生高水平血清抗体,抗体效价为1∶204800;以APP血清7型攻毒小鼠,AfrA蛋白免疫组小鼠存活率为50%,而佐剂对照组和PBS对照组小鼠存活率分别为25%和20%。【结论】AfrA蛋白是一个高度保守的铁调节蛋白,存在于除血清10型外的所有检测血清型中,可诱导小鼠产生血清抗体,并对APP血清7型攻毒发挥部分免疫保护效果,具有研发成为亚单位疫苗组分的潜力。