羊副流感病毒5型RT-qPCR检测方法的建立与应用OA

目的快速诊断和监测羊副流感病毒5型(PIV5)的流行情况,建立检测PIV5的SYBR Green RT-qPCR方法。方法选择岩羊副流感病毒5型(PnPIV5)SH基因为靶标,构建重组质粒pET30a-PnPIV5-SH;评估该方法敏感性、特异性及重复性,并对临床样品进行检测。结果所建立的RT-qPCR反应体系为退火温度60℃、引物浓度0.2μmol/L、模板量2μL(10 ng/μL);重组质粒pET30a-PnPIV5-SH在10^(8)~10^(1) copies/μL内与Ct值有较好的线性关系,线性相关系数R^(2)为0.9978;对重组质粒pET30a-PnPIV5-SH和PnPIV5 RNA样品的检测下限分别为10 copies/μL、0.01 ng/μL;仅能特异性扩增PIV5,对羊痘病毒(SPV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛结节皮肤病病毒(LSDV)、羊口疮病毒(ORFV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、山羊副流感病毒3型(GPIV3)扩增结果均为阴性;组内和组间重复性变异系数均小于4%;与文献中qPCR方法同时检测57份临床样品,两种方法检测结果一致,阳性检出率均为39%(22/57)。结论本研究建立了一种特异性强、敏感性高、重复性好的羊PIV5 SYBR Green RT-qPCR检测方法,可用于临床快速定量检测,为PIV5的流行病学调查和主动监测提供技术支持。