萝卜硫素通过激活Nrf2/HO-1通路抑制铁死亡减轻肠缺血再灌注损伤OA

目的肠缺血再灌注(ischemia-reperfusion,IR)损伤是临床常见的危重病理过程。铁死亡作为一种以铁依赖性脂质过氧化失控积累为特征的细胞死亡方式,已被证实参与肠IR中。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是机体调控铁死亡的关键通路,激活Nrf2可抑制铁死亡从而减轻组织损伤。萝卜硫素(sulforaphane,SFN)作为Nrf2的经典激活剂,具有抗氧化保护作用。本研究探讨SFN是否通过激活Nrf2通路抑制铁死亡减轻肠IR损伤。方法(1)基于TCMSP、GeneCards、OMIM等在线数据库检索并整合SFN相关靶基因、铁死亡相关基因及肠IR损伤相关基因,取交集基因绘制Venn图;将交集基因导入STRING构建蛋白质-蛋白质互作(protein-protein interaction,PPI)网络,并使用Cytoscape(v3.9.1)软件进行拓扑分析筛选核心基因。采用分子对接技术预测SFN与Nrf2的潜在结合能力;(2)选用24只SPF级6~8周龄雄性C57BL/6小鼠[体质量(22±2)g],按随机数字表法分为(n=6):假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(IR组)、萝卜硫素干预组(IR+SFN组)和抑制剂干预组(IR+SFN+ML385组)。除Sham组,其余各组夹闭肠系膜上动脉45 min后,再灌注30 min建立IR损伤模型;IR+SFN组、IR+SFN+ML385组于造模前1 h腹腔注射SFN(5 mg/kg),IR+SFN+ML385组于造模前2 h腹腔注射ML385(一种Nrf2的特异性抑制剂,30 mg/kg)。再灌注30 min后取小肠组织,HE染色光镜下观察病理变化,并采用Chiu''s评分评价肠损伤程度;采用生化试剂盒检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH);Western blotting检测长链脂酰辅酶A合成酶4(acyl-coa synthetase long-chain family member 4,ACSL4)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)及Nrf2、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)蛋白表达。结果(1)网络药理学分析获得SFN靶基因162个、铁死亡相关基因2772个、肠IR损伤相关基因2100个,三者交集基因43个;PPI网络拓扑分析筛得包括Nrf2在内的核心基因36个。分子对接显示SFN可与Nrf2形成结合构象,对接结合能为-3.3 kcal/mol。(2)体内实验结果显示:与Sham组相比,IR组肠组织黏膜损伤明显加重,Chiu’s评分升高(P<0.05),MDA升高而SOD和GSH降低(P<0.05);同时GPX4下调而ACSL4上调(P<0.05),提示肠IR发生铁死亡。SFN预处理可改善上述病理与生化改变,并上调Nrf2与HO-1表达(P<0.05),同时使GPX4回升、ACSL4下调(P<0.05);加入ML385后,SFN的保护效应及其对Nrf2/HO-1轴与铁死亡相关蛋白的调控作用被部分逆转(P<0.05)。结论SFN可减轻肠IR损伤,其作用可能与增强Nrf2/HO-1信号轴相关抗氧化反应、改善铁死亡相关分子变化有关。