幽门螺杆菌感染经激活NF-κB信号通路上调胃上皮细胞GPRC5C表达而促炎症进展OA

目的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染是慢性胃炎的主要病因,本研究旨在明确H.pylori感染是否诱导胃上皮细胞表达G蛋白偶联受体C类第5组成员C(G protein-coupled receptor class C group 5 member C,GPRC5C),验证其上游NF-κB信号通路的调控作用,并阐明GPRC5C在H.pylori相关胃炎中的生物学功能,为相关胃炎的防治提供潜在新靶点。方法将190只6~8周龄雌性SPF级C57BL/6J小鼠(体质量18~22 g)按简单随机抽样法分为(n=95):未感染组(PBS灌胃)和H.pylori感染组(H.pylori灌胃)。小鼠连续灌胃5次,每日2次,分别于感染后第1~19周,每周每组随机处死5只小鼠,持续19周,以建立体内感染模型;运用qRT-PCR、Western blotting以及免疫组织化学染色检测小鼠胃黏膜组织GPRC5C表达情况;人胃组织标本取自陆军军医大学第一附属医院普外科胃癌患者距肿瘤边缘至少5 cm处的正常胃组织,运用免疫组织化学染色检测人胃组织GPRC5C蛋白表达情况。小鼠原代胃上皮细胞由未感染小鼠胃组织经酶消化及机械解离后,过滤制备单细胞悬液,再以CD326磁珠通过MACS系统分离获得。利用GES-1细胞系和小鼠原代胃上皮细胞建立H.pylori感染胃上皮细胞模型,运用qRT-PCR、Western blotting检测GES-1细胞及小鼠原代胃上皮细胞GPRC5C表达;通过信号通路阻断实验筛选并验证H.pylori感染胃上皮细胞诱导GPRC5C表达时激活的细胞内信号通路;利用双荧光素酶报告基因技术分析H.pylori感染后,GPRC5C启动子区全长、各截短序列的启动子活性变化以及信号通路抑制剂对GPRC5C启动子活性的影响。取6~8周龄雌性C57BL/6J WT小鼠和雌性Gprc5c-/-小鼠各5只(体质量18~22 g),构建H.pylori感染小鼠模型;利用HE染色评价胃组织炎症,初步探究GPRC5C在H.pylori感染相关胃炎中的效应功能。结果与未感染组相比,H.pylori感染后第14周小鼠胃黏膜组织中GPRC5C的mRNA水平显著上调(P<0.0001),小鼠及人胃黏膜组织中GPRC5C蛋白表达水平亦升高。在体外实验中,与未感染组相比,H.pylori感染后GES-1细胞及小鼠原代胃上皮细胞GPRC5C mRNA及蛋白表达水平均升高,其中mRNA表达水平分别升高了4.1倍和3.1倍(P<0.01),该上调效应呈感染菌量和感染时间依赖性;与单独H.pylori感染组相比,NF-κB信号通路被阻断剂预处理后,H.pylori诱导胃上皮细胞GPRC5C表达上调受到显著抑制,抑制率达64.0%(P<0.01);双荧光素酶报告基因实验结果显示,与未感染组相比,H.pylori感染后GPRC5C启动子活性升高至对照组的4.1倍(P<0.001);当阻断NF-κB信号通路后,GPRC5C启动子活性受到显著抑制,抑制率达66.1%(P=0.0002)。功能验证方面,与H.pylori感染的WT小鼠相比,H.pylori感染Gprc5c-/-小鼠胃组织炎症显著降低(P<0.001)。结论H.pylori感染通过激活NF-κB信号通路诱导胃上皮细胞表达GPRC5C,后者进而促进了H.pylori感染相关胃炎进展。