肠上皮离子通道蛋白TMEM16A缺失致小鼠肠内分泌细胞分化及上皮稳态受损并焦虑样行为增强OA

目的跨膜蛋白16A(transmembrane member 16A,TMEM16A)参与肠上皮离子转运与分泌稳态,但其对肠内分泌细胞(enteroendocrine cells,EECs)功能及肠-脑轴相关行为的影响尚不明确。探讨肠上皮TMEM16A缺失对嗜铬粒蛋白A(chromogranin A,CgA)阳性EECs分化表型、相关肠脑信号分子、海马炎症信号及焦虑样行为的影响,并分析迷走神经传入通路在其中的作用。方法选取8~10周龄、体质量24~26 g的雄性肠上皮TMEM16A条件敲除(KO)小鼠及同窝对照(WT)小鼠。将WT小鼠末端回肠黏膜分别给予DMSO、T16Ainh-A01或CaCCinh-A01处理,通过短路电流检测Ca^(2+)激活性Cl-分泌;通过Western blotting和免疫荧光染色比较WT与KO小鼠肠上皮TMEM16A表达。比较WT与KO小鼠在旷场实验、高架十字迷宫实验和明暗箱实验中的行为学指标。将WT与KO小鼠分别给予胆囊收缩素-皂草素偶联物(cholecystokinin-saporin conjugate,CCK-SAP)或空白皂草素对照物处理,分为WT+BlnkSAP、WT+CCK-SAP、KO+Blnk-SAP和KO+CCK-SAP组(n=10),评价CCK敏感性迷走神经传入通路的参与作用。通过免疫组化染色和qPCR比较WT与KO小鼠肠组织中CgA+EECs分化表型。将WT和KO来源类器官分为未处理组和骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)处理组,检测类器官分化表型及5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、色氨酸羟化酶1(tryptophan hydroxylase 1,TPH1)、胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)和肽YY(peptide YY,PYY)水平;通过免疫组化染色和Western blotting检测肠上皮更新相关分子;通过免疫荧光染色和Western blotting检测海马CA3区炎症相关信号。结果与DMSO组相比,TMEM16A抑制剂可降低肠上皮Ca^(2+)激活性Cl-分泌(P<0.0001)。与WT组相比,KO组肠上皮TMEM16A表达降低(P<0.0001),肠绒毛及隐窝上皮TMEM16A免疫荧光信号减弱,旷场总运动距离、中心区停留时间和站立次数均减少(P<0.0001),高架十字迷宫总运动距离和开放臂停留时间减少(P=0.0171,P<0.0001),闭合臂停留时间增加(P=0.0460),明箱进入次数和停留时间减少(P<0.0001),探鼻次数无明显变化。与KO+Blnk-SAP组相比,KO+CCK-SAP组开放臂停留时间由1.75%增至13.16%(P<0.0001),闭合臂停留时间减少(P=0.0045),旷场总运动距离和中心区域停留时间增加(P=0.0002,P=0.0238),明箱停留时间和进入次数增加(P=0.0023,P=0.0055)。与WT小鼠相比,KO小鼠肠道CgA+EECs数量及CgA mRNA表达降低(P<0.0001),成熟出芽类器官比例由WT组的77.80%降至KO组的23.60%(P<0.0001),5-HT及TPH1水平降低(P<0.0001);BMP4处理后,WT组类器官5-HT、TPH1、GLP-1和PYY水平升高(P<0.0001,P<0.0001,P<0.0001,P=0.0060),而KO组经BMP4处理后未见显著变化;KO组肠道CgA、Lgr5和Ascl2表达降低(P<0.0001,P<0.0001,P=0.0016),Ki67、Wnt3a、β-catenin、Dll1和EGF表达升高(P<0.0001),海马CA3区NLRP3和IL-1β表达增强(P<0.0001)。结论肠上皮TMEM16A缺失可减弱CgA+EECs分化表型,降低5-HT、TPH1、GLP-1和PYY水平,并伴随海马CA3区NLRP3/IL-1β炎症信号增强和焦虑样行为;CCK敏感性迷走神经传入通路参与TMEM16A缺失相关焦虑样行为。