miR-27b通过抑制PPAR-γ/Bcl-2信号通路促进H_(2)O_(2)诱导的心肌细胞凋亡而加重心肌缺血再灌注损伤OA

目的氧化应激诱导的心肌细胞凋亡是心肌缺血再灌注(myocardial ischemia-reperfusion,MIR)损伤的核心环节,微小RNA-27b(microRNA,miR-27b)在其中呈异常表达,但其对MIR损伤的影响及调控机制尚待阐明。本研究旨在阐明miR-27b通过PPAR-γ/Bcl-2信号通路调控H_(2)O_(2)诱导的心肌细胞凋亡的分子机制,为MIR损伤的干预提供新靶点。方法(1)将10~12周龄健康雄性C57BL/6J小鼠(体质量24~30 g)采用随机数字表法分为(n=6):MIR组和假手术(Sham)组。MIR组通过左前降支冠状动脉结扎45 min后,再灌注模拟心肌损伤,Sham组进行上述相同手术操作但不结扎。术后24 h取心脏组织,整个心脏组织切片后使用TTC染色30 min以评估梗死范围,左心室前壁缺血区域心肌组织则用于提取总RNA。(2)分离1~3日龄原代新生小鼠心室细胞(primary neonatal mouse ventricular cells,PNMVCs),用miR-27b模拟物或反义miR-27b寡核苷酸(anti-miR-27b oligonucleotide,AMO-miR-27b)转染24 h,并使用H_(2)O_(2)(100µmol/L)处理24 h诱导心肌细胞凋亡。使用PPAR-γ拮抗剂T0070907(10.0 nmol/L)处理转染后的心肌细胞,48 h后检测心肌细胞凋亡情况。细胞实验分为正常对照组(Control组)、H_(2)O_(2)模型组、miR-27b模拟物转染+H_(2)O_(2)组、AMO-miR-27b转染+H_(2)O_(2)组、AMO-miR-27b+H_(2)O_(2)+T0070907组及阴性对照+H_(2)O_(2)组(NC+H_(2)O_(2)组)。采用RT-qPCR检测miR-27b及PPAR-γ表达,MTT法分析细胞活力,TUNEL法染色与DAPI染色共定位定量检测细胞凋亡,Western blotting检测PPAR-γ、Bcl-2、Bax、Cyt-c蛋白表达。结果(1)与Sham组相比,MIR组小鼠心脏切片TTC染色后可清晰观察到梗死区域较大,左心室前壁缺血区域心肌组织中miR-27b的表达水平显著上调(P<0.05)。(2)与正常对照组相比,H_(2)O_(2)处理的PNMVCs中miR-27b的表达水平显著上调(P<0.01)。PNMVCs中过表达miR-27b可诱导心肌细胞损伤,表现为细胞活力下降[(48.75±5.55)%vs(87.20±3.52)%,P<0.01]及细胞凋亡增加[(41.08±2.84)%vs(1.75±0.29)%,P<0.01],同时伴随PPAR-γmRNA和蛋白表达水平降低(P<0.01)。而抑制miR-27b的表达则可提升PPAR-γmRNA(P<0.05)及蛋白(P<0.01)水平的表达。在H_(2)O_(2)处理的心肌细胞中,应用AMO-miR-27b可下调miR-27b的表达(P<0.01)。MTT实验结果显示,AMO-miR-27b能够减轻H_(2)O_(2)诱导的细胞活力下降[(79.46±6.41)%vs(60.29±4.83)%,P<0.01];TUNEL检测进一步表明,转染AMO-miR-27b后,H_(2)O_(2)所致的心肌细胞凋亡显著减少[(19.60±2.95)%vs(42.96±5.80)%,P<0.01]。H_(2)O_(2)处理后导致心肌细胞中Bcl-2表达水平显著降低(P<0.01)、Bax表达水平升高(P<0.01),而AMO-miR-27b可逆转这一变化。此外,暴露于H_(2)O_(2)的心肌细胞中细胞质Cyt-c蛋白水平显著增加(P<0.01),而AMO-miR-27b对细胞质Cyt-c蛋白的下调作用(P<0.05)以及对心肌细胞凋亡的保护作用(P<0.01)被PPAR-γ拮抗剂T0070907所抵消。结论心肌组织和心肌细胞氧化应激损伤后miR-27b高表达,加重组织损伤和细胞凋亡,抑制PPAR-γ/Bcl-2信号通路可能是其主要作用机制,提示靶向抑制miR-27b可能是干预MIR损伤的潜在新策略。