补肾化痰方调控HIF-1信号通路对MC3T3-E1细胞有氧糖酵解的影响OA

目的:基于缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路探讨补肾化痰方对小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1有氧糖酵解的作用,进一步探究补肾化痰方干预绝经后骨质疏松(PMOP)机制。方法:将小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1分为空白组,补肾化痰方低、中、高质量浓度组(0.01、0.05、0.1 g·L^(-1)),淫羊藿苷组(0.1 g·L^(-1))。碱性磷酸酶染色法(ALP)、茜素红染色法(ARS)测定各组细胞成骨活性与矿化结节;透射电镜观察成骨细胞线粒体、粗面内质网等超微结构变化;免疫荧光法(IF)检测Runt相关转录因子2(Runx2)、成骨相关转录因子抗体(Osterix)的表达;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞上清液中丙酮酸(PA)、乳酸(LA)水平;Seahorse XF96细胞外流量分析仪测量细胞外酸化率(ECAR);蛋白免疫印迹法(Western blot)检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、HIF-1β、丙酮酸脱氢酶激酶同工酶1(PDK1)、己糖激酶2(HK2)、M2型丙酮酸激酶同工酶2(PKM2)蛋白的表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测HIF-1α、HIF-1β、PDK1、HK2、PKM2 mRNA表达。结果:与空白组比较,各给药组MC3T3-E1细胞ALP染色与ARS染色阳性表达面积明显增强(P<0.05,P<0.01);胞内粗面内质网显著扩张,数量增多,溶酶体数量也有所增加;Runx2、Osterix荧光强度显著升高(P<0.01);细胞上清PA、LA表达量显著升高(P<0.01);细胞同时间段内ECAR明显上调(P<0.05);HIF-1α、HK2、PDK1、PKM2蛋白及mRNA表达水平明显上调(P<0.05,P<0.01)。结论:补肾化痰方可以通过上调HIF-1信号通路调控MC3T3-E1成骨细胞有氧糖酵解,促进骨形成。