牛结节性皮肤病病毒ORF16基因缺失重组病毒的构建与增殖能力分析OA

构建牛结节性皮肤病病毒(LSDV)ORF16基因缺失的重组LSDV,并探究其增殖能力,为探究ORF16基因生物学功能及开发LSDV减毒活疫苗候选株奠定基础。通过同源重组将ORF16靶标基因、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)筛选标记表达框和缺失ORF16基因的LSDV左、右同源臂片段,进行融合PCR技术扩增拼接,随后将所得融合片段克隆至pUC19T载体中,构建重组质粒pUC19T-LSDVΔORF16-EGFP。将供体质粒转染至Vero细胞,并感染LSDV/FJ/CHA/2021毒株,对该病毒进行拯救。利用挑取绿色荧光单克隆细胞及细胞亚克隆方法纯化重组毒株(LSDVΔORF16-EGFP)。通过PCR和病毒基因组测序实验方法验证重组病毒。经连续传代鉴定该病毒的遗传稳定性。利用一步生长曲线测定其增殖能力。结果显示,成功构建了转移载体pUC19T-LSDVΔORF16-EGFP,并获得了纯化的重组病毒LSDVΔORF16-EGFP。PCR和病毒基因组测序结果证实ORF16基因已被成功缺失并替换为EGFP筛选标记基因。荧光显微镜下可见不同代次的重组病毒绿色荧光稳定表达,重组病毒基因组稳定性良好。一步生长曲线显示,在感染后的第24~96小时内,LSDVΔORF16-EGFP的病毒滴度与LSDVΔTK无显著差异,重组病毒的增殖能力良好。本研究成功构建了ORF16基因缺失的重组LSDV,重组病毒的增殖能力良好,为后续研究该基因生物学功能及其在LSDV致病性中的生物学功能提供了材料及理论支撑。