针刀对膝骨关节炎兔软骨细胞自噬和基质降解的影响OA

目的:探讨针刀对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)软骨细胞自噬和基质降解相关蛋白的影响。方法:选取6月龄健康雄性新西兰兔18只,体质量为(2.0±0.5)kg,随机分为空白组、模型组和针刀组,每组6只。参照改良Videman法将兔左后肢伸直位石膏固定制动6周建立KOA模型,空白组不予固定,空白组及模型组不予干预,针刀组采用针刀干预,每周1次,持续4周。1周后采用Kellgren-Lawrence(K-L)分级、磁共振膝骨关节炎(MRI osteoarthritis knee score,MOAKS)评分评估左膝关节骨赘、间隙、软骨光滑度、积液;采用奎森运动功能指数(Lequesne MG评分)评价针刀对兔膝关节症状体征及活动功能的影响。1周后处死兔观察左膝关节的软骨形态;采用番红O-固绿染色光镜观察左膝关节软骨的病理变化;原位末端转移酶标记技术(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)染色检测膝关节软骨细胞凋亡率;实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitativepolymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测膝关节软骨细胞自噬及软骨基质降解调控分子肌球蛋白样Bcl2结合蛋白(myosinlike bcl2 interacting protein,Beclin-1)、轻链3(light chain 3,LC3)、miR-107、胱天蛋白酶-1(cysteine aspartate-specific protease-1,Caspase-1)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、Ⅱ型胶原蛋白(collagen typeⅡ,CollagenⅡ)、基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)、基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)mRNA和蛋白表达水平。结果:与空白组相比,模型组膝关节软骨表面存在缺损,结构模糊不清,基质染色变浅,细胞排列紊乱,多呈簇集分布,数量明显减少,潮线紊乱、模糊不清;软骨细胞凋亡率上升,K-L分级、MOAKS评分、Lequesne MG评分、肉眼观评分升高,软骨组织Caspase-1、IL-1β、MMP-3、MMP-13 mRNA及蛋白表达水平上调,差异均有统计学意义(P<0.01);软骨组织Beclin-1、LC3、miR-107、CollagenⅡmRNA及Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、CollagenⅡ蛋白表达水平下调,差异均有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,针刀组膝关节软骨表面较平整,缺损较少,结构较清楚,基质染色较均匀、正常,细胞排列较整齐且数量增多,潮线更为清晰完整;K-L分级、MOAKS评分、Lequesne MG评分、肉眼观评分降低,差异均有统计学意义(P<0.05);软骨细胞凋亡率下降,软骨组织Caspase-1、IL-1β、MMP-3、MMP-13 mRNA及蛋白表达水平下调,差异均有统计学意义(P<0.01);软骨组织Beclin-1、LC3、miR-107、CollagenⅡmRNA及Beclin-1、CollagenⅡ蛋白表达水平显著上调(P<0.01),软骨组织LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:基于经筋理论的针刀治疗能通过调控Beclin-1、LC3、miR-107、Caspase-1等蛋白表达来促进软骨细胞自噬,减少凋亡,抑制软骨基质降解,降低炎症水平,延缓关节软骨退变,发挥保护软骨和改善膝关节疼痛及功能障碍的作用。