抗GDF8单克隆抗体P249337的制备、鉴定及体内促肌肉生长功能研究OACHSSCD

目的制备性质优良的生长分化因子8(GDF8)单克隆抗体,系统评价其理化性质、体外中和活性及在动物模型中对骨骼肌的促肌肉生长功能。方法以重组人GDF8蛋白免疫BALB/c小鼠构建杂交瘤细胞库,筛选分泌阳性单克隆抗体的细胞株;应用Protein A亲和层析纯化抗体;SDS-PAGE、高效尺寸排阻色谱及鲎试剂法分别检测抗体纯度、聚合状态及内毒素水平;通过ELISA检测抗体结合活性并计算半效结合浓度(EC_(50));采用Western blotting检测成肌细胞C2C12中p-SMAD3表达水平评价抗体体外中和能力;取8周龄雄性昆明小鼠按10 mg/kg剂量腹腔注射抗体,每周2次,持续4周,动态监测小鼠体质量、前肢抓力,检测腓肠肌湿质量、肌纤维横截面积,同步检测心功能相关指标;ELISA试剂盒检测血清中GDF8含量。结果获得可稳定分泌抗GDF8抗体的杂交瘤细胞株GYM329;纯化后抗体P249337的分子组成完整,单体含量≥99%,内毒素含量<0.1 EU/μg,符合注射用生物制品标准;P249337的EC_(50)为0.06940 mg/L;在体外可剂量依赖性地阻断C2C12细胞SMAD3的磷酸化;与对照组相比,抗体治疗组小鼠体质量、前肢绝对及相对抓力、双侧腓肠肌湿质量、肌纤维横截面积均显著增加(P<0.05);血清中活性形式GDF8含量显著降低(P<0.01);心率、心搏输出量、左心室射血分数及心室收缩功能无显著差异(P>0.05)。结论抗GDF8单克隆抗体P249337具有良好的分子完整性和均一性,具有很强的抗原结合能力和体外中和活性,能显著促进骨骼肌生长,且对心脏功能无影响,为研发肌肉萎缩性疾病治疗用新型生物制剂奠定了基础。