夏枯草酸性多糖对SARS-CoV-2刺突蛋白诱导细胞损伤的保护作用OA

目的探讨夏枯草多糖(PVP)对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突蛋白(SP)诱导细胞损伤的保护作用及其阻断病毒进入的潜在机制。方法通过水提醇沉法制备PVP,采用多角度激光光散射-示差折光联用技术(SEC-MALLS-RI)测定其绝对分子量,通过离子色谱及扫描电镜表征其单糖组成与微观形态,将过表达人血管紧张素转换酶2(ACE2)的人胚胎肾293T细胞(hACE2-293T细胞)分为SP 1.5625、3.125、6.25、12.5、25 mg⋅L^(-1)组、PVP 3.125、6.25、12.5、25、50、100 mg⋅L^(-1)组和SP+PVP(PVP 0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 mg⋅L^(-1)处理2 h后加入SP 25 mg⋅L^(-1))组,分别作用48 h,通过CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,使用PVP 3.125、6.25、12.5、25、50和100 mg⋅L^(-1)与携带荧光素酶报告基因的Omicron假病毒(PsV)处理hACE2-293T细胞,采用以下4种方式进行时间添加实验:多糖与病毒预孵育、多糖与细胞预孵育、病毒吸附期间加入多糖和病毒吸附后加入多糖,同时设细胞对照和PsV组,评估PVP对SP介导的病毒进入过程的影响。采用表面等离子共振(SPR)技术定量检测PVP与SP、ACE2蛋白的结合动力学及竞争抑制效能。结果PVP由2个分子量的多糖构成,绝对重均分子量(Mw)分别为35.119 ku(76.81%)和7.348 ku(23.19%);主要单糖组分和摩尔百分比分别为葡萄糖26.25%、木糖22.49%、半乳糖19.37%和鼠李糖11.96%;表面较平滑,呈不规则团块状聚集。与细胞对照组相比,PVP组hACE2-293T细胞活力无明显变化,细胞凋亡率显著降低;SP 25 mg⋅L^(-1)组细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著增加。与SP 25 mg⋅L^(-1)组相比,PVP 12.5、25、50和100 mg⋅L^(-1)处理可显著抑制SP诱导的hACE2-293T细胞活力下降和凋亡。时间添加实验结果显示,PVP在多糖与病毒预孵育、多糖与细胞预孵育及病毒吸附期间加入多糖,3种给药模式下均能显著抑制假病毒进入,半数抑制浓度(IC_(50))分别为43.11、18.91和25.25 mg⋅L^(-1)。SPR动力学分析表明,PVP与SP和ACE2蛋白均具有较高的表观亲和力,表观平衡解离常数(KD)分别为7.624和5.560μmol·L^(-1),且随PVP浓度升高SP和ACE2蛋白的结合响应值呈明显下降趋势。结论PVP可直接干扰SP与ACE2受体的结合,有效阻断SP介导的病毒吸附和进入,对SP诱导的细胞损伤发挥显著保护作用。