基于PI3K/Akt/mTOR信号通路调控自噬探讨化瘀解毒方含药血清对糖氧剥夺联合凝血酶诱导损伤星形胶质细胞的作用及机制OA

目的基于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路调控自噬探讨化瘀解毒方含药血清对糖氧剥夺联合凝血酶诱导损伤星形胶质细胞的作用及机制。方法采用糖氧剥夺联合凝血酶诱导损伤星形胶质细胞作为急性缺血性脑卒中体外模型。含药血清制备:将SD大鼠随机分为空白组、化瘀解毒方组,每组8只;化瘀解毒方灌胃剂量为35 g·kg^(-1),每日1次,连续7 d。将星形胶质细胞随机分为空白组、糖氧剥夺组、糖氧剥夺+凝血酶组、化瘀解毒方含药血清组、水蛭素(10^(-5) mol·L^(-1))组、LY294002(PI3K抑制剂,10µmol·L^(-1))组、化瘀解毒方含药血清+LY294002(10µmol·L^(-1))组。化瘀解毒方含药血清及水蛭素在模型复制(糖氧剥夺+凝血酶)前24 h加入,LY294002在模型复制(糖氧剥夺+凝血酶)前2 h加入。采用MTT法检测细胞存活率;检测细胞内乳酸脱氢酶(LDH)漏出率;TUNEL法检测细胞凋亡率;电镜观察细胞超微结构;Western Blot法检测细胞LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平。结果(1)选择凝血酶浓度50 U·mL^(-1)、糖氧剥夺4 h作为最佳干预浓度及时间进行造模;选择5%化瘀解毒方含药血清作为最佳作用浓度进行后续干预。(2)与空白组比较,糖氧剥夺组、糖氧剥夺+凝血酶组星形胶质细胞在镜下可见胞体受损明显,细胞间隙增宽,细胞分离皱缩,胞体变小,胞间间距变大;细胞存活率显著下降(P<0.01);LDH漏出率显著升高(P<0.01);细胞凋亡率显著升高(P<0.01);细胞内可见大量自噬小体及自噬溶酶体的形成,细胞器结构破坏较明显;细胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著上调(P<0.01),p62、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达均显著下调(P<0.01)。与糖氧剥夺组或糖氧剥夺+凝血酶组比较,化瘀解毒方含药血清组及水蛭素组细胞损伤程度减轻,细胞贴壁较紧密,胞体变圆润,细胞间连接恢复紧密;细胞存活率显著升高(P<0.01);LDH漏出率显著下降(P<0.01);细胞凋亡率显著降低(P<0.01);细胞结构损伤程度较轻,自噬小体及自噬溶酶体数目明显减少;细胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著下调(P<0.01),p62、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达均显著上调(P<0.01)。(3)与糖氧剥夺+凝血酶组比较,LY294002组星形胶质细胞形态结构的损伤无明显变化;细胞存活率、LDH漏出率无明显变化(P>0.05);细胞凋亡率显著升高(P<0.01);细胞结构损伤、自噬小体及自噬溶酶体数目无明显变化;细胞LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白表达明显上调(P<0.05,P<0.01),p-PI3K/PI3K、p-mTOR/mTOR蛋白表达显著下调(P<0.01),p-Akt/Akt蛋白表达无明显变化(P>0.05)。(4)与LY294002组比较,化瘀解毒方含药血清+LY294002组的细胞形态得到明显改善;细胞存活率显著升高(P<0.01);细胞LDH漏出率显著下降(P<0.01);细胞凋亡率显著降低(P<0.01);细胞可见自噬小体及自噬溶酶体减少;细胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著下调(P<0.01),p62、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达均显著上调(P<0.01)。结论化瘀解毒方含药血清可减轻糖氧剥夺联合凝血酶诱导对星形胶质细胞的损伤,其作用机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,降低星形胶质细胞自噬的过度表达有关。