利用CRISPR/Cas9联合Cre-lox系统快速构建重组HVT-HA(Y280)OA
H9N2亚型禽流感病毒Y280谱系新型变异株的出现,对养禽业构成新的威胁,现有的商品化疫苗难以提供完全保护。旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以火鸡疱疹病毒(HVT)为载体,构建表达H9N2 Y280分离株血凝素(HA)蛋白的重组病毒。首先,设计并合成靶向HVT基因组US2非必需区的gRNA,同时构建CRISPR/Cas9表达质粒及携带红色荧光蛋白(RFP)和HA基因的供体质粒。将上述重组质粒共转染鸡胚成纤维细胞,经嘌呤霉素加压筛选后,再接种HVT。待出现表达RFP的病毒蚀斑后,通过连续3轮蚀斑纯化,获得表达HA蛋白的重组病毒HVT-RFP-HA。随后,利用Cre-lox系统切除RFP标记基因,再经3轮无荧光蚀斑纯化,最终获得无筛选标记的重组病毒HVT-HA。通过PCR和测序对外源基因插入位点进行鉴定,并将重组病毒连续传代20次以评估其遗传稳定性。结果表明,HA基因已准确插入HVT基因组的US2位点;连续传代20次后,HA基因仍稳定保留。本研究成功建立了基于NHEJ-CRISPR/Cas9与Cre-lox系统的重组HVT载体疫苗快速构建平台,所获重组病毒HVT-HA遗传稳定性良好,为H9N2 Y280谱系变异株的防控提供了候选疫苗株,但其免疫保护效果尚需进一步验证。
张俊峰;陈明倩;杨云竹;关丽君;宁尚波;高伟娜;赵战勤;薛云;张贺伟;陈松彪;陈建;魏颖;尚珂
河南科技大学医学技术与工程学院/分子诊断实验室,河南洛阳471000 中国人民解放军联勤保障部队第九八九医院,河南洛阳471000河南科技大学医学技术与工程学院/分子诊断实验室,河南洛阳471000河南科技大学动物科技学院,河南洛阳471000河南科技大学动物科技学院,河南洛阳471000河南科技大学医学技术与工程学院/分子诊断实验室,河南洛阳471000河南科技大学医学技术与工程学院/分子诊断实验室,河南洛阳471000河南科技大学动物科技学院,河南洛阳471000河南科技大学医学技术与工程学院/分子诊断实验室,河南洛阳471000洛阳职业技术学院食品与药品学院,河南洛阳471000河南科技大学动物科技学院,河南洛阳471000河南科技大学动物科技学院,河南洛阳471000河南科技大学动物科技学院,河南洛阳471000河南科技大学动物科技学院,河南洛阳471000 中国人民解放军联勤保障部队第九八九医院,河南洛阳471000
农业科技
H9N2HA基因NHEJ-CRISPR/Cas9HVT-HA
《信阳师范大学学报(自然科学版)》 2026 (3)
P.382-389,8
国家自然科学基金项目(32402897)河南省高等学校重点科研项目(25A310006,25A230005)河南省科技攻关项目(252102111004)河南省大学生创新训练计划项目(S202510464076)农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室开放课题(AMLKF202410)河南科技大学大学生创新创业训练计划项目(2025293)。
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