毛兰素对人胃癌细胞的抑制作用及其机制OA

目的探讨毛兰素对人胃癌AGS细胞和HGC27细胞的抑制作用及其机制。方法体外培养人胃癌AGS和HGC27细胞,采用MTT法检测不同终浓度(0、10、20、40、60、80nmol/L)的毛兰素处理48h后两种细胞细胞活力的改变。将AGS和HGC27细胞分别分为A1~D1组与A2~D2组,分别采用浓度0、10、20、40nmol/L毛兰素处理48h;将AGS和HGC27细胞再分别分为E1~H1组与E2~H2组,其中E1、E2组转染阴性对照siRNA,F1、F2组转染核糖体蛋白L27(RPL27)siRNA,G1、G2组转染阴性对照质粒,H1、H2组转染RPL27过表达质粒。采用细胞集落形成实验和细胞划痕实验检测A1~H1组与A2~H2组细胞的增殖及迁移能力;采用DCF染色、DHE染色及JC-1染色检测A1~D1组与A2~D2组细胞的活性氧水平及线粒体膜电位水平;通过Western blot实验检测A1~D1组与A2~D2组细胞中上皮-间质转化(EMT)、细胞周期及细胞凋亡相关蛋白表达水平,以及A1~H1组及A2~H2组细胞中RPL27蛋白的相对表达水平。通过转录组测序筛选A1组与B1组细胞间的差异表达基因,并进行GO功能与KEGG通路富集分析。将筛选出的差异表达基因与GeneCards数据库中筛选出的线粒体相关代谢基因进行韦恩分析和统计学比较,分析RPL27作为毛兰素作用靶点的可能性,并进一步通过AutoDock4.2.6软件分析预测毛兰素与RPL27的分子对接能力及其结合能。结果MTT实验结果显示,随着毛兰素浓度升高,AGS和HGC27细胞活力逐渐降低(F=85.62、89.61,tLSD=2.36~28.72,P<0.05)。细胞集落形成实验和细胞划痕实验显示,A1~D1组与A2~D2组的细胞集落形成数量及细胞迁移率均随浓度升高逐渐降低(F=22.37~102.31,tLSD=5.52~41.57,P<0.05);DCF染色、DHE染色及JC-1染色实验结果显示,B1~D1组与A1组、B2~D2组与A2组比较,细胞中活性氧水平随浓度升高而逐渐升高,细胞的线粒体膜电位水平随浓度升高而逐渐降低(F=98.20~189.20,tLSD=3.24~38.89,P<0.05)。Western blot实验结果显示,C1~D1组与A1组、C2~D2组与A2组比较,EMT相关蛋白(Vimentin、N-cadherin)、细胞周期相关蛋白(Cyclin D1、CDK2)及细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bcl-xL)相对表达水平显著降低,而EMT相关蛋白(E-cadherin)及细胞凋亡相关蛋白(Bad、Bax、PARP1p25)相对表达水平显著升高(F=78.90~150.20,tLSD=2.89~19.73,P<0.05)。GO功能与KEGG通路富集分析显示,A1组与B1组的差异表达基因显著富集于DNA复制、细胞周期、PI3K-AKT信号通路及线粒体相关生物学过程(P<0.05),其中RPL27的降幅差异显著(P<0.05);分子对接分析显示,毛兰素与RPL27之间的结合能是-4.84kcal/mol;Western blot实验显示,C1~D1组与A1组、C2~D2组与A2组比较,RPL27表达水平显著降低(F=112.10、138.80,tLSD=4.56~22.32,P<0.05);F1组与E1组、H1组与G1组、E2组与F2组、G2组与H2组比较,RPL27蛋白相对表达水平显著降低(F=78.21、77.35,tLSD=3.56~5.94,P<0.05),细胞集落形成数量和细胞迁移率均显著性降低(F=88.58~100.25,tLSD=14.38~150.30,P<0.05)。结论毛兰素对人胃癌细胞的增殖和迁移均具有显著抑制作用,其作用机制可能为靶向抑制RPL27的表达,进而损伤细胞的线粒体功能,并激活细胞凋亡程序。