有机磷水解酶和兔源对氧磷酶1突变体的异源表达及其水解乙基对氧磷活性比较OA

目的基于毕赤酵母系统异源表达纯化有机磷水解酶突变体(OPHDS5)和兔源对氧磷酶1突变体(RabPON1 G3C9),进而比较两者体内外水解乙基对氧磷活性。方法①体外实验:构建OPHDS5和RabPON1 G3C9的毕赤酵母表达载体并诱导蛋白表达,依次经硫酸铵沉淀、疏水作用层析及离子交换层析逐级纯化蛋白;二者以乙基对氧磷为底物评价比酶活和酶动力学参数。②体内实验:将雄性SD大鼠分为对照组、OPHDS5组(iv给予OPHDS515、30和60μg·kg^(-1))和RabPON1 G3C9组(iv给予RabPON1 G3C96和12 mg·kg^(-1)),对照组给予等体积生理盐水,给药后2 min内sc给予2倍半数致死剂量(LD_(50))乙基对氧磷,观察大鼠24 h内的生存情况及中毒症状,并记录存活大鼠7 d内体重变化情况,筛选有效防致死剂量;并通过血常规检测(给药7 d后)、溶血性实验和心肝脾肺肾的HE染色评价有效防致死剂量下的初步安全性。结果①成功构建二者的毕赤酵母表达载体,并纯化得到高纯度的OPHDS5和RabPON1 G3C9,且质谱结果显示二者的氨基酸序列与目标序列一致;体外以乙基对氧磷为底物,测得OPHDS5的比酶活〔(296.00±7.76)U·mg^(-1)〕显著高于RabPON1 G3C9的比酶活〔(3.00±0.09)U·mg^(-1)〕,且OPHDS5的催化速率(k_(cat)/K_(m))〔(5.68×10^(5))L·mol^(-1)·s^(-1)〕高于RabPON1 G3C9的k_(cat)/K_(m)〔(1.25×10^(4))L·mol^(-1)·s^(-1)〕。②给予2倍LD_(50)乙基对氧磷后,对照组大鼠全部死亡,OPHDS560μg·kg^(-1)组大鼠全部存活且未出现明显毒副作用,7 d内体重呈正增长趋势,RabPON1 G3C96和12 mg·kg^(-1)组大鼠全部死亡。OPHDS560μg·kg^(-1)组大鼠血常规、溶血性实验和HE染色均未见异常。结论OPHDS5体外水解乙基对氧磷活性及水解效率显著优于RabPON1 G3C9,OPHDS560μg·kg^(-1)为2倍LD_(50)乙基对氧磷染毒后的有效防致死剂量且该剂量在体内具备初步安全性。