HAdV-5 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及其在猪群感染调查和rAdV5滴度测算中的应用OA

为了建立检测人腺病毒5型(HAdV-5)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,用于猪群中HAdV-5感染情况调查和重组腺病毒5型载体(rAdV5)滴度的初步测算。本试验将HAdV-5与猪腺病毒(pAdV)六邻体(Hexon)基因序列比对后,根据HAdV-5 Hexon基因特定区域设计特异性引物和探针,经过反应条件优化,建立HAdV-5 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,评价该方法的敏感性、特异性和重复性;使用该方法检测临床样品,评估其临床应用效果,并分析该方法与间接免疫酶染色法测定rAdV5滴度的关联性。敏感性试验结果显示,本试验建立方法的最低检测限为10 copies/μL,比常规PCR敏感性高100倍。特异性试验结果显示,该方法可准确检测质粒标准品,与其他猪常见病原核酸均无交叉反应。重复性试验结果显示,该方法组内和组间重复变异系数均小于2%,重复性良好。利用该方法对来自黑龙江、贵州、山东和浙江4个省的400份猪临床样品进行检测,结果全部为阴性。所建立方法对6株rAdV5的病毒拷贝数测定结果与间接免疫酶染色法测定的病毒滴度有良好的相关性,可利用测算公式将拷贝数快速换算为滴度。结果表明,本试验建立的HAdV-5 TaqMan实时荧光定量PCR方法可用于对猪群中HAdV-5感染情况进行摸底调查和快速测算rAdV5滴度,同时为基于rAdV5载体开发的疫苗和治疗制剂在猪群中的应用提供理论依据。