水稻粒型调控蛋白OsLTPL108的原核表达、纯化及亚细胞定位OA

【目的】对调控水稻粒型的脂质转移蛋白(OsLTPL108)进行原核表达、纯化及亚细胞定位,为解析该蛋白的生物学功能及其调控粒型的分子机制提供理论参考。【方法】从UniProt数据库获取OsLTPL108基因编码区(CDS)序列,设计其引物进行PCR扩增,并对扩增产物进行电泳检测及测序,采用生物信息学软件预测其编码蛋白的理化性质、跨膜结构域、信号肽、亲/疏水性及亚细胞定位。将OsLTPL108基因序列连接至pGEX-2T上,构建原核表达载体pGEX-2T-OsLTPL108,并诱导其在大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL中表达,对纯化的目的蛋白进行免疫印迹杂交验证。同时,构建pRHV-OsLTPL108-cGFP亚细胞定位载体,通过转化水稻原生质体后观察其亚细胞定位。【结果】以水稻品种丁香B的cDNA为模板,扩增获得的OsLTPL108基因长度为477 bp,与RGAP数据库中粳稻登录号为LOC_Os03g14654的基因序列完全一致。OsLTPL108基因编码158个氨基酸残基,蛋白相对分子量为15.66 kD,理论等电点为8.7,N端第1~30位氨基酸含有跨膜结构域,第31~158位为可溶性结构域;N端第1~24位氨基酸构成典型信号肽序列,推测该蛋白属于分泌型蛋白。OsLTPL108蛋白的核心区域(第30~120位氨基酸)含有1个完整的非特异性LTP家族标志性结构域(Pfam登录号PF14368),由8个高度保守的半胱氨酸残基构成。pGEX-2T-OsLTPL108原核表达载体转化原核表达系统后,18℃、0.1 mmol/L IPTG低温诱导过夜,OsLTPL108蛋白的表达量较高。成功获得分子量约39.64 k D的GST-OsLTPL108融合蛋白,且条带单一,无明显的非特异性条带。蛋白质谱鉴定获得3条与OsLTPL108蛋白匹配的特异性肽段,外源表达纯化的OsLTPL108蛋白序列正确。pRHV-OsLTPL108-cGFP亚细胞定位载体转化水稻原生质体后,OsLTPL108-EGFP融合表达蛋白的绿色荧光信号呈网状分布,与内质网定位蛋白OsHLP1-mCherry的红色荧光信号完全重叠,证明该蛋白定位于水稻原生质体的内质网上。【结论】OsLTPL108属于分泌型蛋白,通过添加助溶标签GST可利用原核表达系统获得高纯度的可溶性融合蛋白,可用于后续的蛋白抗体制备。OsLTPL108蛋白定位于水稻细胞的内质网,由于内质网是植物脂质合成主要场所,推测OsLTPL108蛋白发挥脂质转运的功能。