基于“主客交”理论的补虚通络法抗肝纤维化大鼠的分期调控效应的蛋白质组图谱OA

目的采用蛋白质组学技术探讨芪甲柔肝方抗肝纤维化的分期疗效差异机制。方法采用皮下注射四氯化碳(CCl4)+橄榄油的方式建立大鼠肝纤维化分期模型。104只SD大鼠随机分为13个组:正常组(Control组)、模型-2、4、6、8周组(Model-2W、4W、6W、8W组),芪甲柔肝方-2、4、6、8周组(QRF-2W、4W、6W、8W组),复方鳖甲软肝片-2、4、6、8周组(FBR-2W、4W、6W、8W组)。药物干预2周后。采集大鼠肝脏组织和腹主动脉血样检测。苏木素-伊红(HE)、马松(Masson)染色,天狼星红(PSR)染色观察肝组织病理损伤和胶原纤维沉积;免疫组化(IHC)检测肝组织纤维化标志物含量。全自动生化分析仪检测血清肝功能指标;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清肝纤维化指标水平。取Control组、各期Model组、各期QRF组肝组织,采用非标记定量蛋白质组学分析各组差异蛋白,并利用蛋白免疫印迹法(Western blot)对关键蛋白进行验证;最后对差异蛋白进行生物信息学分析。结果(1)CCl4+橄榄油构建的大鼠肝纤维化分期模型,在造模第2、4、6、8周病理结果符合F1、F2、F3、F4期Metavir标准;与Control组比较,各期Model组α-肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)蛋白的表达明显增高(P<0.05),各期Model组大鼠血清肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、直接胆红素(DBIL)、总胆红素(TBil)水平显著升高(P<0.01),各期Model组大鼠血清肝纤维化指标Ⅲ型前胶原肽(PⅢP),Ⅳ型胶原蛋白(Ⅳ-C),透明质酸(HA),层粘连蛋白(LN)水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。研究成功构建了肝纤维化大鼠分期模型。(2)与各期Model组比较,同时间点各期给药组肝细胞气球样变减少,肝细胞排列较Model组规整,炎症细胞浸润减少;蓝染胶原纤维明显变细、变薄,纤维间隔缩小、变窄;胶原纤维面积及PSR染色面积缩小(P<0.05)。α-SMA、CollagenⅠ表达阳性面积明显减少(P<0.05),各期Model组大鼠ALT、AST、ALP、DBIL、TBil水平显著降低(P<0.05,P<0.01),各期Model组大鼠PⅢP,Ⅳ-C,HA,LN水平明显降低(P<0.05)。其中各项指标改善以F3期最为显著(P<0.01)。(3)蛋白组学结果显示:4个期Model组与Control组比较和QRF组与Model组比较共有165个差异蛋白呈回调趋势;Western blot检测NAD(P)H醌氧化还原酶1(NQO1)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、精氨酸酶1(Arg1)、谷胱甘肽S-转移酶α1(GSTA1)水平与蛋白质组学结果一致。生物信息学结果显示165个差异蛋白富集到多条信号通路,发现药物代谢-细胞色素P450、精氨酸生物合成、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路与肝纤维化密切相关,提示芪甲柔肝方可能通过调节上述通路发挥分期调控肝纤维化分期调控的作用。结果芪甲柔肝方可能是通过调节药物代谢-细胞色素P450、精氨酸生物合成、PPAR信号通路分期调控肝纤维化。