新加黄芪建中汤通过FoxO3/ROS调控线粒体功能缓解小鼠胃癌前状态OA

目的探讨新加黄芪建中汤(HQJZ)缓解胃癌前状态(GPC)的作用及其机制。方法在体外实验中,使用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝-基胍(MNNG)诱导人胃黏膜上皮细胞发生恶性转化,建立GPC细胞模型(MC细胞)。体外实验分为4组:正常组,模型组,新加黄芪建中汤低剂量组(HQJZ-L)、高剂量组(HQJZ-H),正常组和模型组给予完全培养基培养,HQJZ-L和HQJZ-H组在此基础上分别给予新加黄芪建中汤低剂量(0.5 g·L-1)、高剂量(1.0 g·L-1)进行干预。采用细胞增殖与活性检测-8(CCK-8)法评估新加黄芪建中汤对细胞的增殖抑制作用,Transwell实验检测MC细胞侵袭能力,采用Annexin V-FITC/PI法检测MC细胞凋亡情况,免疫荧光法分析活性氧的水平及线粒体自噬情况变化,并采用蛋白免疫印迹法(Western blot)验证关键通路中的蛋白表达。在体内实验中,采用MNNG诱导健康BALB/c小鼠建立GPC动物模型,将24只小鼠分为4组:正常组、模型组、HQJZ-L、HQJZ-H,正常组和模型组的小鼠给予生理盐水(10 mL·kg^(-1)·d^(-1))灌胃,HQJZ-L和HQJZ-H组分别给予新加黄芪建中汤低剂量(6.24 g·kg^(-1)·d^(-1))、高剂量(12.48 g·kg^(-1)·d^(-1))灌胃,给药结束后,用苏木素-伊红(HE)染色、AB-PAS染色观察各组小鼠胃组织病理学变化。通过免疫荧光检测小鼠胃黏膜中活性氧(ROS)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)的水平,原位末端标记法(TUNEL)染色检测胃黏膜细胞的凋亡率。通过Western blot和免疫组织化学法(IHC)分析增殖细胞相关抗原(Ki67)、黏膜增殖细胞核抗原(PCNA)、叉头框蛋白O3(FoxO3)的表达水平。结果细胞活力实验结果显示,与正常组比较,HQJZ以浓度依赖的方式降低MC的细胞活力(P<0.05,P<0.01)。Transwell实验结果显示,与正常组比较,模型组细胞侵袭能力明显增强(P<0.05);与模型组比较,HQJZ各组细胞侵袭能力明显减弱(P<0.05)。小鼠胃黏膜病理结果显示,肉眼观察胃黏膜可见,与正常组比较,模型组小鼠HE和AB-PAS病理评分上升(P<0.05);与模型组比较,HE和AB-PAS病理评分下降(P<0.05)。透射电子显微镜观察小鼠胃黏膜上皮线粒体形态,与正常组比较,模型组小鼠胃黏膜线粒体数量增多,体积变大;与模型组比较,HQJZ各组小鼠胃黏膜线粒体结构异常,粗面内质网形态、分布均显著改变,表现为扩张型、空心状。线粒体检测、细胞凋亡检测显示,与正常组比较,模型组细胞线粒体绿色荧光(Mito-Tracker Green)信号增强(P<0.05),DCFH-DA荧光信号没有显著变化,线粒体红色荧光(Mito Tracker Red CMXRos)信号没有显著变化,ROS免疫荧光染色没有显著变化,GSH水平明显上升(P<0.05),MDA水平没有显著变化,LC3荧光信号明显增强(P<0.05),细胞凋亡率没有显著变化,细胞和小鼠血清ATP含量明显上升(P<0.05);与模型组比较,HQJZ各组线粒体绿色荧光信号明显降低(P<0.05),DCFH-DA荧光信号、红色荧光信号、MDA水平、LC3荧光信号、细胞凋亡率明显增加(P<0.05),细胞ATP含量明显降低(P<0.05),HQJZ-L组ROS免疫荧光染色、GSH水平没有显著变化,HQJZ-H组ROS免疫荧光信号、GSH水平明显增强(P<0.05)。免疫组化与Western blot结果显示,与正常组比较,模型组PCNA、Ki67阳性细胞数量明显增高(P<0.05),FoxO3、SIRT1和B细胞淋巴瘤因子-6(Bcl-6)的蛋白水平上升(P<0.05);与模型组比较,HQJZ各组中PCNA、Ki67阳性细胞数量明显减少(P<0.05),FoxO3、SIRT1和Bcl-6蛋白水平明显降低(P<0.05)。结论HQJZ可通过FoxO3/ROS途径调控线粒体功能、促进GPC恶变细胞的凋亡,从而缓解胃癌前病变的发展。