基于Wnt/β-catenin信号通路探讨改良通络糖泰方改善糖尿病周围神经病变髓鞘损伤的作用机制OA

目的基于网络药理学和体外实验探讨改良通络糖泰方(MTLTT)对糖尿病周围神经病变(DPN)髓鞘损伤的作用及分子机制。方法通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库及文献检索查找MTLTT化学成分,运用瑞士靶点预测平台(SwissTargetPrediction)数据库收集成分靶点。通过人类基因卡片数据库(GeneCards)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、疾病-基因关联数据库(Disgenet)、基因表达综合数据库(GEO)收集DPN靶点;利用元富集分析平台(Metascape)数据库进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析;使用Cytoscape 3.7.1软件构建网络图;采用Autodock Vina分析核心成分与糖原合成激酶-3β(GSK-3β)和β-连环蛋白(β-catenin)的结合作用。高糖诱导雪旺细胞/背根神经元细胞(SCs/DRGs)共培养细胞构建DPN体外模型,通过扫描电子显微镜(SEM)观察SCs和DRGs的超微结构形态变化,免疫荧光染色法检测髓鞘相关糖蛋白(MAG)、髓鞘碱性蛋白(MBP)表达,结合实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测MAG、MBP、髓鞘蛋白0(P0)、外周髓鞘蛋白22(PMP22)和Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路相关β-catenin、糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、Wnt家族成员3α(Wnt3α)、Wnt信号通路抑制因子-1(Wif-1)的mRNA及蛋白表达水平。结果网络药理学分析显示,MTLTT成分可能通过Wnt信号通路治疗DPN,涉及GSK-3β、β-catenin、Wif-1等关键蛋白。分子对接结果表明,阿托品(atropine)、芹菜素(apigenin)、黄芩素(baicalein)、异黄烷酮(isoflavanone)、芍药内酯苷(albiflorin)与GSK-3β具有良好的结合活性,所有的13个核心成分均与β-catenin具有稳定的结合活性。细胞实验显示,与空白组比较,模型组SCs和DRGs出现崩解、皱缩、轴突断裂等形态结构的严重异常,与模型组比较,MTLTT干预后,SCs和DRGs的形态结构异常得到改善;免疫荧光结果显示,与空白组比较,模型组MAG、MBP荧光强度显著下降(P<0.01),与模型组比较,MTLTT组显著提升MAG、MBP表达水平(P<0.01);Real-time PCR及Western blot结果显示,与空白组比较,模型组髓鞘相关分子MAG、MBP、P0、PMP22表达水平明显下降(P<0.05,P<0.01),与模型组比较,MTLTT能够明显上调髓鞘相关分子MAG、MBP、P0、PMP22表达水平(P<0.05);Wnt/β-catenin信号通路中,与空白组比较,模型组GSK-3β、Wif-1、Wnt3αmRNA显著升高(P<0.01),β-catenin mRNA表达显著下降,GSK-3β、Wif-1蛋白表达显著升高(P<0.01),Wnt3α、β-catenin蛋白表达显著下降(P<0.01),与模型组比较,MTLTT各剂量组GSK-3β、Wif-1 mRNA和蛋白表达都有不同程度降低(P<0.05),Wnt3α、β-catenin蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论MTLTT可减轻高糖诱导的髓鞘损伤,其保护机制可能是通过上调MAG、MBP、P0、PMP22的表达,以促进髓鞘修复,其治疗机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。