利用CRISPR-Cas9文库筛选识别膀胱癌中潜在的三级淋巴结构形成调节因子OA

目的:通过CRISPR-Cas9文库筛选影响三级淋巴结构(tertiary lymphoid structure,TLS)形成的调节因子,鉴定潜在的关键调控分子,为提升膀胱癌免疫治疗疗效提供新靶点。方法:基于小鼠全基因组文库,筛选44个趋化因子相关基因,设计并构建靶向这些基因的单向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)文库,每个基因配置3条sgRNA。利用慢病毒包装系统将文库质粒感染HEK293T细胞,获得慢病毒文库并感染小鼠膀胱癌细胞系MB49。通过嘌呤霉素筛选获得稳定过表达趋化因子的MB49-mCherry细胞株。将细胞接种于C57BL/6小鼠腹腔,建立膀胱癌移植瘤模型,观察肿瘤生长情况。3周后剥离肿瘤组织,提取基因组DNA进行高通量测序,分析sgRNA富集情况,筛选差异表达的趋化因子基因。同时,通过免疫组织化学染色检测TLS标志物CD20和CD3,评估TLS数量、分布及成熟度。对筛选出的候选基因进行单独体内验证,进一步确认其对TLS形成的影响。结果:成功构建了包含132条sgRNA的细胞因子基因文库,覆盖44个趋化因子基因。慢病毒感染后获得稳定表达文库的MB49-mCherry细胞株,流式分选获得失活的Cas9阳性单克隆细胞株,确保后续实验的均一性和可重复性。小鼠腹腔肿瘤实验显示,实验组肿瘤组织中TLS数量较对照组明显增多,主要分布于肿瘤边缘。高通量测序结果显示,与对照组相比,实验组中Cxcl16 sgDNA显著富集,Ccl20和Cx3cl1 sgDNA则较初始有所下降(P<0.05)。进一步通过腹腔注射分别验证各趋化因子的作用,发现给予CX3CL1组肿瘤中TLS数量减少,提示CX3CL1可能负向调控TLS形成。免疫组织化学结果显示,CX3CL1处理组肿瘤组织中CD20阳性B细胞和CD3阳性T细胞聚集减少,TLS结构不完整。结论:通过CRISPR-Cas9文库筛选结合体内验证,初步鉴定出CX3CL1可能为调控膀胱癌TLS形成的负向调节因子。CX3CL1高表达与TLS数量减少相关,提示其在膀胱癌免疫微环境中可能发挥抑制作用,这为深入理解膀胱癌中TLS形成的分子机制提供了新的线索和研究方向,但CX3CL1是否可作为免疫治疗靶点,仍需后续结合临床样本、多维度分子机制解析及免疫治疗响应相关性研究进行进一步验证。