基于肠道菌群与血清代谢组学探讨“益髓醒神”针刺对大脑中动脉闭塞/再灌注大鼠脑缺血再灌注损伤的保护效应机制OA

目的基于大脑中动脉闭塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)大鼠模型,运用16S rRNA基因测序及非靶向代谢组学,探讨“益髓醒神”针刺对大鼠脑缺血再灌注损伤的脑保护作用及潜在机制。方法将45只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、针刺组,每组15只。模型组与针刺组采用MCAO/R法构建脑缺血再灌注损伤大鼠模型,假手术组仅分离血管。针刺组于造模当天起连续7天予“益髓醒神”针刺干预,每次20分钟;模型组、假手术组连续7天予相应时长束缚。分别于造模当天及末次治疗后采用改良神经功能缺损评分(modified Neurological Severity Score,mNSS)评估三组大鼠神经功能损伤情况;于造模后3天采集三组大鼠脑组织,行2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色观察成模情况及脑梗死面积;末次干预后禁食12小时,取血进行非靶向代谢组学检测以分析血清代谢物变化,取脑组织行苏木精—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察海马组织病理改变,采集盲肠内容物进行16S rRNA基因测序,分析肠道菌群多样性、物种组成、物种差异及功能。结果与假手术组比较,模型组mNSS评分显著升高(P<0.01),TTC染色可见明显脑梗死区域,海马CA1区组织结构受损;与模型组比较,针刺组mNSS评分降低(P<0.01)、脑梗死面积减少(P<0.05),海马病理损伤减轻。肠道菌群分析显示,模型组Shannon指数和Simpson指数较假手术组降低(P<0.05),菌群结构发生明显偏移(P<0.01),模型组气球菌属、异杆菌属、双歧杆菌属及梭菌XI群相对丰度降低(P<0.05或P<0.01);针刺组菌群结构及部分菌门、菌属相对丰度较模型组呈调整趋势,针刺组较模型组异杆菌属、双歧杆菌属及瘤胃球菌属相对丰度升高(P<0.05或P<0.01)。血清代谢组学分析显示,模型组较假手术组筛选出363个差异代谢物,针刺组较模型组筛选出171个差异代谢物;两组比较共有31个共同差异代谢物,其中28个呈相反变化趋势,主要涉及脂肪酸/脂肪酰基代谢、酰基肉碱代谢、甘油脂代谢及甘油磷脂代谢。京都基因与基因组百科全书富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)显示,MCAO/R后血清差异代谢物主要涉及胆固醇代谢、亚油酸代谢、初级胆汁酸生物合成、谷胱甘肽代谢及脂肪酸代谢等通路;针刺干预后差异代谢物主要富集于甘油磷脂代谢、胆碱代谢、不饱和脂肪酸代谢、初级胆汁酸生物合成及芳香族氨基酸代谢等通路。Spearman相关性分析显示,mNSS评分与多种回调型脂质相关代谢物及双歧杆菌属、瘤胃球菌属、异杆菌属等差异菌属存在显著相关关系,且差异菌属与多种脂质相关代谢物之间存在相关性。结论“益髓醒神”针刺可改善MCAO/R大鼠神经功能缺损,并减轻脑组织缺血再灌注损伤。肠道菌群和血清代谢组学结果提示,针刺的脑保护作用可能与调节脑缺血再灌注损伤后肠道菌群紊乱及血清脂质代谢异常有关。