Sestrin2通过激活AMPK/mTOR通路减轻内质网应激抑制滋养层细胞焦亡改善妊娠期糖尿病胎盘损伤OA

目的妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)可通过内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)诱导滋养层细胞焦亡,导致胎盘损伤。通过GDM体内及体外模型,旨在探讨Sestrin2通过激活AMPK/mTOR通路减轻ERS,从而抑制滋养层细胞焦亡,并改善GDM胎盘损伤。方法①体外实验:将HTR-8/SVneo细胞分为正常糖(NG,含5.5 mmol/L葡萄糖的培养基,48 h)组、等渗对照(MN,含5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇的培养基,48 h)组及高糖(HG,含30 mmol/L葡萄糖的培养基,48 h)组;为调控Sestrin2表达,设高糖+oe-NC(HG+oe-NC,高糖处理前24 h转染oe-NC对照质粒)组、高糖+oe-Sestrin2(HG+oe-Sestrin2,高糖处理前24 h转染oe-Sestrin2过表达质粒)组、高糖+si-NC(HG+si-NC,高糖处理前24 h转染si-NC对照)组及高糖+si-Sestrin2(HG+si-Sestrin2,高糖处理前24 h转染si-Sestrin2特异性siRNA)组;为干预内质网应激,设高糖+4-PBA(HG+4-PBA,高糖处理前1 h加入20 mmol/L 4-PBA)组和高糖+si-Sestrin2+4-PBA(HG+si-Sestrin2+4-PBA,高糖处理前24 h转染si-Sestrin2,高糖处理前1 h加入20 mmol/L 4-PBA)组;为抑制AMPK通路,设oe-Sestrin2+AMPK-IN-3(oe-Sestrin2+AMPK-IN-3,高糖处理前24 h转染oe-Sestrin2,高糖诱导前2 h加入12.5μmol/L AMPK-IN-3)组;所有细胞实验均独立重复3次(n=3)。②体内实验:将C57BL/6J雌性小鼠分为对照组(Control,正常饲料喂养)组、GDM模型(GDM,高脂高糖饮食诱导1个月)组、GDM+oe-NC(高脂高糖饮食诱导1个月,并于妊娠第8.5天尾静脉注射空载体对照oe-NC)组及GDM+oe-Sestrin2(高脂高糖饮食诱导1个月,并于妊娠第8.5天尾静脉注射Sestrin2过表达腺相关病毒oe-Sestrin2)组,每组6只,记录妊娠期体质量、血糖。Western blotting检测ERS标志物(GRP78、CHOP、p-IRE1α、IRE1α、p-PERK、PERK)、焦亡相关蛋白(NLRP3、GSDMD-N、cleaved-caspase-1)及AMPK/mTOR通路蛋白(p-AMPK、AMPK、mTOR、p-mTOR);qPCR检测Sestrin2 mRNA;ELISA测定炎症因子(IL‑18、IL‑1β)含量;CCK‑8和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放试验评估细胞活力与毒性;免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)分析Sestrin2与GRP78的相互作用。HE染色检测胎盘组织病理学变化。结果HG组ERS标志物、焦亡相关蛋白、LDH释放率及炎症因子均高于NG组(P<0.05),细胞活力低于NG组(P<0.05),而4-PBA可逆转上述变化(P<0.05)。与HG+oe-NC组相比,HG+oe-Sestrin2组Sestrin2及细胞活力升高,ERS标志物、焦亡相关蛋白、炎症因子及LDH释放率降低(P<0.05);与HG+si-NC组相比,HG+si-Sestrin2组呈现相反趋势(P<0.05);4-PBA可部分抵消si-Sestrin2的效应(P<0.05),但不影响Sestrin2表达。在AMPK/mTOR通路方面,HG组p-AMPK较NG组升高(P<0.05)、p-mTOR较NG组降低(P<0.05);MN组与NG组无差异(P>0.05);与HG+oe-NC组相比,HG+oe-Sestrin2组p-AMPK升高(P<0.05)、p-mTOR降低(P<0.05);AMPKIN-3可阻断oe-Sestrin2的保护作用,表现为ERS标志物、焦亡蛋白、炎症因子、LDH释放率、p-mTOR均显著升高(P<0.05),p-AMPK、细胞活力下降(P<0.05),但不影响Sestrin2表达。Co-IP实验显示Sestrin2不与GRP78结合。体内实验显示,与Control组相比,GDM组胎盘病理评分、体质量增量及血糖均升高(P<0.05),胎盘组织中Sestrin2、p-AMPK、GRP78、CHOP、NLRP3、GSDMD-N升高(P<0.05),p-mTOR降低(P<0.05);GDM组与GDM+oe-NC组无统计学差异(P>0.05);GDM+oe-Sestrin2组胎盘病理评分、体质量增量及血糖较GDM+oe-NC组降低(P<0.05),胎盘组织中p-mTOR、GRP78、CHOP、NLRP3、GSDMD-N较GDM+oe-NC组降低(P<0.05),而Sestrin2、p-AMPK较GDM+oe-NC组升高(P<0.05)。结论Sestrin2通过激活AMPK/mTOR通路减轻高糖诱导的滋养层细胞内质网应激,从而抑制细胞焦亡,改善GDM相关的胎盘损伤。