樟叶越桔蛋白磷酸酶2A结构A亚基基因PP2AA的克隆及表达分析OA

【目的】克隆樟叶越桔(Vaccinium dunalianum)蛋白磷酸酶2A结构A亚基基因(VdPP2AA)的全长cDNA,分析其编码蛋白的结构特征及组织表达模式,为解析VdPP2AA基因在樟叶越桔生长发育、次生代谢及抗逆性中的调控机制及樟叶越桔的遗传改良提供参考依据。【方法】以樟叶越桔8个组织为研究对象,基于樟叶越桔三代转录组数据库筛选VdPP2AA基因序列并设计引物。以樟叶越桔不同组织总RNA为模板,采用PCR对VdPP2AA基因进行全长cDNA克隆。结合测序和生物信息学分析,系统分析VdPP2AA蛋白的理化性质、保守结构域、信号肽、亲/疏水性、跨膜结构域、二级结构和三级结构及VdPP2AA基因的密码子偏好性。基于PP2AA氨基酸序列相似性构建24个物种的系统发育树,并进行同义密码子使用度(RSCU)分析。采用实时荧光定量PCR检测樟叶越桔不同组织中VdPP2AA基因的相对表达量。【结果】成功克隆获得VdPP2AA基因的cDNA序列,该基因的开放阅读框长度为1764 bp,编码587个氨基酸残基,分子量为65.579 kD;VdPP2AA蛋白共有42个潜在磷酸化位点,包括31个丝氨酸(Ser)位点、10个苏氨酸(Thr)位点和1个酪氨酸(Tyr)位点。VdPP2AA蛋白不含跨膜螺旋结构域,为非跨膜和非分泌蛋白;VdPP2AA蛋白包含几乎覆盖了整个蛋白序列的HEAT superfamily结构域;二级结构以α-螺旋为主;三级结构预测结果显示,VdPP2AA蛋白由15个HEAT重复组成,每个重复包含2个反平行α-螺旋。在VdPP2AA基因中鉴定出26个高频密码子,其RSCU>1.00;这26个高频密码子多以A或U结尾,密码子适应性指数(CAI)为0.71,说明VdPP2AA基因具有较高的潜在表达效率。系统发育树分析结果显示,不同物种的PP2AA高度保守。RSCU聚类分析进一步证明PP2AA的进化具有保守性。实时荧光定量PCR结果显示,VdPP2AA基因在8个樟叶越桔组织中均有表达,但表达水平存在明显差异,其在嫩叶中的相对表达量最高,显著高于除花以外的其他组织(P<0.05)。【结论】成功克隆并鉴定了VdPP2AA基因,PP2AA在不同生物中的进化高度保守,VdPP2AA基因可能参与樟叶越桔的生长发育、次生代谢及抗逆性响应。