白藜芦醇通过调控TLR4及其甲基化水平缓解同型半胱氨酸诱导的小鼠胰岛β细胞氧化损伤OA

目的探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)通过调控Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)基因及其甲基化水平缓解同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)诱导小鼠胰岛β细胞氧化损伤的机制。方法采用CCK-8法检测不同浓度的Hcy和Res对小鼠胰岛β细胞活力的影响;设置分组:对照(Control)组、Hcy组、Hcy+Res共处理组,丙二醛(MDA)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性试剂盒、酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞MDA水平、GSH-Px活力、胰岛素水平;荧光染色法检测各组细胞氧化应激状态;Western blot和qRT-PCR检测各组细胞TLR4蛋白和mRNA的表达水平;巢式甲基化检测各组细胞TLR4 DNA甲基化表达水平,Western blot检测各组细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)蛋白水平;构建DNMT1小干扰RNA(siRNA)并将其转入胰岛β细胞,设置分组:Hcy组、Hcy+Res组、Hcy+si-NC组、Hcy+si-DNMT1组、Hcy+Res+si-DNMT1组;Western blot检测各组TLR4蛋白水平;采用上述试剂盒检测敲低DNMT1各组MDA水平、GSH-Px活力以及胰岛素水平;构建TLR4 siRNA并将其转入胰岛β细胞的基础上,设置分组:Hcy组、Hcy+si-NC组、Hcy+si-TLR4组、Hcy+Res+si-NC组、Hcy+Res+si-TLR4组,为进一步研究Res自身对TLR4的独立调控作用,增设分组Res+si-NC组、Res+si-TLR4组,采用上述试剂盒检测MDA水平、GSH-Px活力以及胰岛素水平。结果用100μmol/L的Hcy干预后,细胞活力降低,用10μmol/L的Res干预后,能够有效缓解Hcy对胰岛β细胞的损伤;MDA试剂盒、荧光染色结果显示,与Control组相比,Hcy组MDA和活性氧(ROS)水平升高(P<0.05),Hcy+Res组则下降(P<0.05),GSH-Px活性试剂盒、ELISA法结果显示,与Control组相比,Hcy组GSH-Px活性和胰岛素水平降低(P<0.05),Hcy+Res组则升高(P<0.05);Western blot和qRT-PCR结果显示,与Control组相比,Hcy组细胞TLR4蛋白水平、mRNA水平显著升高(P<0.05),Hcy+Res组则显著下降(P<0.05),而巢式甲基化结果显示,TLR4甲基化水平与mRNA表达呈负相关;相较于Control组,DNMT1的蛋白水平在Hcy组中低表达(P<0.05),在Hcy+Res组中高表达(P<0.05);与Hcy+si-NC组相比,Hcy+si-DNMT1组TLR4蛋白表达显著升高(P<0.05),与Hcy+Res组相比,Hcy+Res+si-DNMT1组TLR4蛋白表达进一步升高(P<0.05);与Hcy+si-NC组相比,Hcy+si-DNMT1组MDA水平显著升高(P<0.05),与Hcy+Res组相比,Hcy+Res+si-DNMT1组MDA水平进一步升高(P<0.05);而GSH-Px活力、胰岛素水平变化方向与MDA变化相反;进一步敲低TLR4后MDA水平下降(P<0.05),Res干预后则更低(P<0.05);而GSH-PX活性和胰岛素水平升高(P<0.05),Res干预后则更高(P<0.05)。结论Res能够减轻Hcy诱导的胰岛β细胞氧化损伤,这一过程与TLR4表达及其甲基化水平改变有关。