lncRNA NBR2在肝硬化向肝癌恶性转化过程中的作用实验研究OA

目的本研究通过干扰小鼠lncRNA NBR2的表达,观察lncRNA NBR2在肝硬化向肝癌恶性转化过程中的作用。方法(1)小鼠体内研究。所有C57BL小鼠连续24周腹腔注射二乙基亚硝胺(DEN),完成建模。建模小鼠被随机分为lncRNA NBR2过表达组(AAV-NBR2-GFP)、腺相关病毒空载组(AAV-GFP)及空白对照组(Control),每组14只。建模8周后开腹,在肝包膜下对过表达组、腺相关病毒空载组及空白对照组小鼠分别注射lncRNA NBR2过表达腺相关病毒、空载腺相关病毒和生理盐水,各50μL/只。建模12周后处死每组3只小鼠,将肝组织OCT包埋后行荧光显微镜检测,并行q RT-PCR检测lncRNA NBR2表达。建模24周后处死所有小鼠,观察肝脏肿瘤数目及直径;检测外周血丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB);对肝组织行HE、Sirus Red及Masson染色。(2)HL7702肝细胞体外研究。将shRNA慢病毒转染的HL7702细胞设为lncRNA NBR2敲减组(Lv-shNBR2),慢病毒空载体转染的HL7702细胞设为慢病毒空载组(Lv-NC),正常HL7702细胞设为空白对照组(Control)。qRT-PCR检测三组HL7702肝细胞lncRNA NBR2表达,用平板克隆法检测三组细胞克隆形成能力。用qRT-PCR和蛋白质印迹(WB)检测三组甲胎蛋白(AFP)和细胞角蛋白19(CK19)的m RNA及蛋白表达水平。结果(1)与腺相关病毒空载组及空白对照组比较,lncRNA NBR2过表达组小鼠肝癌肿瘤数目显著减少[(2.0±1.0)vs(5.0±0.7)vs(5.8±0.9)],肿瘤直径显著缩小[(0.9±0.2)cm vs(1.6±0.4)cm vs(1.8±0.3)cm],肝损伤程度明显减轻[ALT:(108.2±14.6)U/L vs(285.6±16.7)U/L vs(278.4±17.6)U/L;AST:(117.4±15.4)U/L vs(311.3±21.6)U/L vs(304.7±19.8)U/L;ALB:(3.8±0.3)g/dL vs(2.7±0.2)g/dL vs(2.8±0.3)g/dL],并且对小鼠肝纤维化形成的抑制作用更加明显;以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。(2)与慢病毒空载组及空白对照组比较,lncRNA NBR2敲减组细胞的克隆形成能力显著增强;qRT-PCR及WB检测显示lncRNA NBR2敲减组AFP及CK19的mRNA和蛋白表达量显著增多(P<0.05)。结论lncRNA NBR2在肝硬化向肝癌恶性转化过程中具有显著的抑制作用。过表达lncRNA NBR2可有效减轻肝损伤与纤维化,减少肝癌的发生发展。其作用机制可能与减弱肝细胞增殖能力及下调AFP、CK19表达有关,提示lncRNA NBR2可能是延缓或阻断该恶性转化进程的关键分子。