鸡毒支原体滑液囊支原体副鸡禽杆菌三重荧光定量PCR检测方法的建立OA

为快速监测鸡毒支原体(MG)、滑液囊支原体(MS)和副鸡禽杆菌(APG)的临床感染情况,为家禽相关疾病的预防、诊断和控制提供科学依据。根据鸡毒支原体的pvpA基因、滑液囊支原体的vlhA基因和副鸡禽杆菌hagA基因序列分别设计3对引物和3条探针;以基因组DNA为模板,通过控制单一变量,优化退火温度、引物浓度和探针浓度,绘制标准曲线,建立三重荧光定量PCR检测方法;对检测方法进行敏感性、特异性和重复稳定性评价,并检测临床样品。结果显示,成功建立了三重荧光定量PCR检测方法,敏感性检测表明MG和MS的最低检测限为10 copies/μL,APG的最低检测限为100 copies/μL。特异性检测表明,以大肠杆菌(E.coli)、多杀性巴氏杆菌(Pm)、沙门菌(Salmonella spp.)、禽白血病病毒(ALV)、禽法氏囊病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)基因组为模板,反应均为阴性;以MG、MS和APG基因组为模板反应均为阳性。重复性检测表明该方法批内试验变异系数小于1.06%,批间试验变异系数小于1.51%。对MG、MS和APG各150份样本进行检测,结果表明该方法比PCR检测的阳性率更高,符合率分别为96.7%、81.3%、95.3%。本研究建立的三重荧光定量PCR检测方法能快速检测MG、MS和APG,可用于这3种病原感染的流行病学调查和临床鉴别检测。