大别班达病毒糖蛋白Gn和Gc中HLA-A^(*)02:01限制性CTL表位的筛选与鉴定OA

目的大别班达病毒(Dabie bandavirus,DBV)感染所致发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopnia syndrome,SFTS)病死率高,目前尚无特效疫苗,而DBV糖蛋白前体(glycoprotein precursor,GP)是重要的免疫靶点,但其细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位尚不明确。本研究以DBV GP为研究对象,通过生物信息学工具预测结合动物体外实验验证的方法筛选并鉴定具有较强免疫原性的CTL表位,为DBV特异性细胞免疫机制研究及表位疫苗设计提供理论依据。方法以DBV HB29株糖蛋白n(glycoprotein n,Gn)和糖蛋白c(glycoprotein c,Gc)氨基酸序列为模板,利用IEDB、NetMHCpan 4.1、STMHCpan 3种生物信息学工具,预测长度为8~11个氨基酸的HLA-A^(*)02:01限制性T细胞表位。经ToxinPred2、AlgPred 2.0评估毒性与致敏性,并通过20株国内DBV分离株序列比对分析保守性。选取在2种及以上工具中结合亲和力排名前2%的作为表位肽。将6~8周龄雌性HLA-A^(*)02:01转基因小鼠随机分为2组(n=2):Gn组和Gc组,分别以Gn(100μg/只)或Gc(100μg/只)联合弗氏佐剂于第0、14、28天进行3次免疫。末次免疫后7 d处死小鼠,取脾脏制备单细胞悬液。使用各表位肽(终浓度25μg/mL)体外刺激脾细胞(5×10^(5)个/孔),采用ELISPOT检测IFN-γ分泌水平,以每10^(5)个脾细胞中斑点形成细胞(spot-forming cell,SFC)值>100为阳性判断标准。为了避免CD4^(+)T细胞分泌IFN-γ对结果的影响,通过磁珠阳性分选法获得CD4^(+)T细胞耗竭的脾细胞(CD4^(+)T cellsdepleted splenocytes,CD4⁻SP),以相同条件再次进行ELISPOT检测,以每104个CD4⁻SP中SFC值>100为阳性判断标准。结果经3种工具交叉预测,共筛选出12条表位肽(Gn1~Gn6、Gc1~Gc6)。各表位肽经免疫原性预测均显示良好潜力,通过毒性及致敏性评估,并且在多地的分离株中表现出良好的保守性。分子对接模拟结果显示,12条表位肽与HLA-A^(*)02:01分子均能形成稳定的对接复合物。ELISPOT结果显示:Gn5、Gn6、Gc1、Gc2、Gc3、Gc4、Gc5、Gc6能显著诱导免疫小鼠脾细胞分泌IFN-γ(SFC值均>100,P均<0.0001);在CD4⁻SP中,Gn5、Gn6、Gc3、Gc4仍能诱导强IFN-γ应答(SFC值均>100,P均<0.0001)。结论本研究成功从DBV中鉴定出4条能特异性诱导CD8^(+)T细胞产生IFN-γ应答的CTL表位(Gn5、Gn6、Gc3、Gc4),并且在国内DBV分离株中高度保守,为DBV多表位疫苗的研发提供了实验依据。