实验鼠8种病原体的高通量多重RT-qPCR检测方法OA

该研究旨在建立一种高效、广谱的多重实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法,用于同步筛查实验大、小鼠中常见的8种重要病原体,包括鼠轮状病毒(Murine rotavirus,MRV)、啮齿类丝状杆菌(Filobacterium rodentium,FR)、隐孢子虫(Cryptosporidium spp.,CP)、百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis,BP)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca,KO)、蠕形螨(Demodex spp.,DE)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni,CJ)及啮齿螺杆菌(Helicobacter rodentium,HR),以克服传统检测方法在通量、速度和病原体覆盖面上的局限。通过生物信息学分析,针对上述病原体的保守序列设计特异性引物与TaqMan探针,采用“三通道荧光分组”策略进行整合,建立了一步法多重RT-qPCR检测流程,并系统完成了线性范围、检测限、特异性及耐用性等方法学验证。结果表明,线性范围宽广(10^(1)~10^(6) copies/μL),扩增效率理想(91%~109%,R^(2)>0.99),检测限低至12.5 copies,且所有技术重复的变异系数(CV)均低于1%。交叉反应实验显示,该方法与常见的鼠肠道内容物DNA及大肠杆菌基因组DNA无交叉,特异性良好。此外,反应液经反复冻融后检测性能无显著变化,表明其具有良好的稳定性。建立的多重RT-qPCR检测方法具有操作简便、快速、灵敏、特异且稳定性高的特点,能同时覆盖病毒、细菌及寄生虫多类别病原体,为实验大、小鼠的规模化健康监测、疾病早期诊断及微生物质量控制提供了一种高效、可靠的分子检测工具。