汉黄芩苷通过调控MAPK与PI3K/Akt信号通路抑制氧糖剥夺诱导的心肌细胞凋亡机制研究OA

目的通过网络药理学及实验验证探索汉黄芩苷(WO)对氧糖剥夺诱导心肌细胞凋亡的影响以及相关信号通路的调控作用。方法CCK-8法筛选出25、50、100μmol/L WO作为低、中、高剂量的最佳干预浓度。采用低氧细胞培养系统构建氧糖剥夺细胞模型,将H9c2细胞分为对照组、模型组和低、中、高剂量组,对照组给予常规常氧培养;模型组和低、中、高剂量组更换无血清培养基,分别加入DMSO溶液和25、50、100μmol/L WO干预,并置于37℃、5%CO_(2)、1%O_(2)和94%N_(2)低氧环境中,均培养24 h。流式细胞术检测细胞凋亡率;JC-1染色法观察细胞线粒体膜电位变化;Western blot检测Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和Cleaved Caspase-3蛋白表达量。运用网络药理学分析汉黄芩苷治疗AMI的潜在靶点,STRING数据库分析潜在靶点间的互作关系,David数据库进行基因本体论(GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。采用Western blot验证5组蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、丝裂原活化蛋白激酶p38、磷酸化p38(p-p38)、细胞外信号调节激酶(ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)蛋白表达量变化。结果与对照组比较,模型组细胞凋亡率明显升高(P<0.05),线粒体膜电位明显降低(P<0.05),Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3/Caspase-3均明显升高(P<0.05);与模型组比较,低、中、高剂量组细胞凋亡率均明显降低(P<0.05),线粒体膜电位均明显升高(P<0.05),Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3/Caspase-3均明显降低(P<0.05)。网络药理学结果显示,共获得汉黄芩苷药物作用靶点418个、AMI疾病靶点5398个,取交集后得到251个交集靶点。GO功能注释发现,凋亡过程的负调控、MAPK级联的正调控等过程被显著富集;KEGG通路富集分析发现,MAPK、PI3K/Akt等信号通路被显著富集。实验验证结果表明,与对照组比较,模型组p-Akt/Akt明显降低(P<0.05),p-p38/p38、pERK/ERK均明显升高(P<0.05);与模型组比较,低、中、高剂量组p-Akt/Akt明显升高(P<0.05),p-p38/p38、pERK/ERK均明显降低(P<0.05)。结论汉黄芩苷可抑制氧糖剥夺诱导的心肌细胞凋亡,下调促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3的表达,上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,其机制可能与抑制MAPK信号通路中ERK、p38的异常磷酸化激活及恢复PI3K/Akt信号通路中Akt蛋白的磷酸化水平有关。