DMRT1促进肺腺癌细胞增殖能力及体内成瘤性的实验研究OA

背景与目的:肺腺癌发病率和死亡率居高不下,严重威胁人类健康。双性和mab-3相关转录因子1(double-sex and mab-3 related transcription factor 1,DMRT1)与多种肿瘤相关。本研究旨在分析DMRT1在肺腺癌中的表达及其对患者不良预后的影响,并探究其在肺腺癌细胞中的作用及相关机制。方法:利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中的肺腺癌样本数据,分析DMRT1在肺腺癌组织中的表达及其与患者生存期的相关性。通过短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)技术构建敲低DMRT1的(shRNA#1和shRNA#2)、shRNA阴性对照的A549和PC9细胞株,同时构建DMRT1过表达A549细胞株(OE-DMRT1),利用IncuCyte^(TM)活细胞分析系统连续监测72 h细胞增殖、平板克隆培养14 d检测克隆形成能力及EdU染色实验温育2 h评估DNA合成水平,并利用流式细胞术检测细胞周期分布与凋亡水平;借助BALB/c裸鼠体内实验观察DMRT1对癌细胞成瘤性的影响。通过转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)技术探究DMRT1调控肺腺癌细胞增殖的潜在信号转导通路,并采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)分析其对细胞周期及凋亡相关基因表达的影响。数据采用GraphPad Prism 10.0软件分析。本研究经上海交通大学医学院附属第九人民医院动物伦理专委会批准(SH9H-2023-A871-1)。结果:TCGA数据库的分析结果表明,DMRT1在肺腺癌中异常高表达,且其表达水平与肺腺癌患者的生存期呈负相关。敲低DMRT1可显著抑制细胞的增殖、克隆形成能力和DNA合成能力(P<0.001),过表达DMRT1可促进A549细胞增殖(P<0.05)。敲低DMRT1也可引发细胞周期G_(0)/G_(1)期阻滞(P<0.001)、诱导细胞凋亡(P<0.001)。裸鼠体内成瘤实验进一步证实,DMRT1敲低可减慢肺腺癌细胞的体内增殖速度(P<0.01)。DMRT1敲低使G_(1)/S期相关基因E2F转录因子1(E2F transcription factor 1,E2F1)、MYC原癌基因(MYC proto-oncogene,MYC)、细胞周期蛋白E2(cyclin E2,CCNE2)和细胞分裂周期蛋白6(cell division cycle 6,CDC6)的表达下调,总Rb蛋白无明显变化,而磷酸化pRb(Ser807/811)水平降低;同时抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,Bcl-2相关X凋亡调节因子(Bcl-2 associated X,apoptosis regulator,Bax)/Bcl-2比值、剪切型caspase-3及剪切型多聚ADP核糖聚合酶水平均上升。结论:DMRT1的高表达与肺腺癌患者的不良预后呈负相关,其可能通过促进E2F介导的细胞周期进程及激活caspase-3凋亡通路,进而增强肺腺癌细胞的增殖活性。