钙化性主动脉瓣疾病中m^(6)A甲基化谱及表观调控机制OA

[目的]构建钙化性主动脉瓣疾病(CAVD)的首个m^(6)A甲基化谱,揭示m^(6)A修饰在瓣膜钙化过程中的表观调控机制。[方法]通过RNA甲基化测序(MeRIP-seq)技术获取CAVD患者瓣膜组织的m^(6)A甲基化谱,运用生物信息学方法进行差异甲基化分析、GO功能注释及KEGG通路富集分析,筛选关键信号通路,以转化生长因子β(TGF-β)信号通路富集最显著;利用主动脉瓣膜间质细胞(AVIC)构建体外细胞钙化模型,采用RT-qPCR及Western blot检测肾母细胞瘤1相关蛋白(WTAP)、甲基转移酶样蛋白3(METTL3)、脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO)、烷基化碱基修复蛋白同源物5(ALKBH5)、YTH结构域家族蛋白1/2(YTHDF1/2)等m^(6)A甲基化关键酶,筛选核心调节因子;采用siRNA技术敲低ALKBH5,检测ALKBH5缺失对AVIC钙化及TGF-β信号通路的作用,并通过ALKBH5过表达实验进行双向验证,明确ALKBH5的作用;通过MeRIP-RT-qPCR对m^(6)A修饰的具体通路靶基因SMAD家族成员2(SMAD2)进行甲基化验证。[结果]通过MeRIP-seq成功获得了CAVD的首个m^(6)A甲基化谱,发现钙化瓣膜组织m^(6)A甲基化修饰水平显著升高(P<0.01),并识别出7412个m^(6)A差异甲基化峰及TGF-β、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、自噬等大量钙化相关的关键信号通路。体外AVIC钙化、ALKBH5敲低及过表达等实验证实,钙化AVIC中去甲基化酶ALKBH5表达下调(P<0.05),ALKBH5敲低可以促进AVIC钙化,过表达则抑制其钙化。进一步机制研究发现,ALKBH5敲低后,钙化AVIC细胞中TGF-βⅡ型受体(TGFBR2)蛋白表达及SMAD2的磷酸化(p-SMAD2)水平均上调(均P<0.05),TGF-β信号通路激活;另外,ALKBH5敲低后,SMAD2基因的m^(6)A甲基化水平升高(P<0.05)。[结论]m^(6)A甲基化修饰参与CAVD瓣膜钙化进程,去甲基化酶ALKBH5表达下调可能通过激活TGF-β信号通路,促进瓣膜间质细胞钙化。