六味地黄丸调控GPNMB表达提高自噬防治阿尔茨海默病的分子机制OA

目的:研究六味地黄丸通过调控糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B(GPNMB)的表达影响快速老化小鼠(SAMP8)海马自噬功能,探讨补肾填精法治疗阿尔茨海默病(AD)的作用机制。方法:实验一采用24只5月龄SAMP8小鼠,随机均分为模型组及六味地黄丸低、中、高剂量(0.59、1.18、2.36 g·kg-1)组,同时以6只同月龄抗老化小鼠(SAMR1)为正常组,通过新物体识别实验评估学习记忆能力,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清皮质醇(Cort)、促肾上腺皮质激素(ACTH)及尿17-羟皮质类固醇(17-OHCS)水平,透射电镜观察海马神经元超微结构,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马组织GPNMB、解整合素样金属蛋白酶10(ADAM10)及自噬相关蛋白表达。实验二将18只SAMP8小鼠随机均分为模型组、载体对照组(Vector)及GPNMB过表达组(GPNMBOE),通过脑立体定位注射慢病毒(GPNMBOE组2μL/侧),Western blot检测海马上述目标蛋白表达;实验三选取24只SAMP8小鼠随机均分为模型组、六味地黄丸组、六味地黄丸+阴性对照组(NC)、六味地黄丸+GPNMB沉默组(shGPNMB),其中六味地黄丸+NC组和六味地黄丸+shGPNMB组在药物治疗前分别注射阴性对照和GPNMB沉默慢病毒,Western blot检测海马上述目标蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组小鼠新物体辨别指数显著降低(P<0.01);与模型组比较,六味地黄丸中、高剂量组小鼠新物体辨别指数显著提高(P<0.01);透射电镜观察到正常组海马组织中可见聚集的自噬溶酶体;模型组以线粒体为主,未见典型特征的自噬小体;六味地黄丸低、中剂量组可见少量的自噬溶酶体及双层膜结构的自噬小体;六味地黄丸高剂量组自噬小体及自噬溶酶体的数量多于低、中剂量组;ELISA和Western blot结果表明,与正常组比较,模型组血清Cort、ACTH及尿17-OHCS水平显著升高,海马ADAM10、苄氯素1(Beclin1)、微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)表达显著降低,GPNMB、泛素结合蛋白p62表达明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,六味地黄丸低、中、高剂量组血清Cort、ACTH水平显著降低,仅六味地黄丸高剂量组尿17-OHCS水平显著下降,六味地黄丸中、高剂量组海马组织GPNMB、ADAM10、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著升高,p62表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较,GPNMBOE组GPNMB、ADAM10、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著升高,p62表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较,六味地黄丸组海马GPNMB、ADAM10、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著上升,p62表达显著下降(P<0.01);与六味地黄丸组比较,六味地黄丸+shGPNMB组GPNMB、ADAM10、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ显著下降,p62表达显著上升(P<0.01)。结论:六味地黄丸可通过上调GPNMB表达提高海马自噬功能,改善AD。