独活寄生汤通过p38 MAPK/HDAC4信号通路调控髓核细胞体外增殖机制研究OA

目的:观察独活寄生汤通过p38分裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)/组蛋白去乙酰基酶4(HDAC4)通路对髓核(NP)细胞增殖凋亡的影响,探讨潜在作用机制。方法:制备独活寄生汤含药血清及从轻度退化的椎间盘组织中分离培养NP细胞,采用白细胞介素(IL)-1β诱导构建NP细胞损伤模型。CCK8法筛选独活寄生汤含药血清最佳作用浓度及时间,采用CCK8和流式细胞术观察对照组,空白血清组,中药血清低、中、高剂量组NP细胞增殖和凋亡的影响;药效实验研究,将NP细胞分为对照组、IL-1β组、中药血清组、IL-1β+中药血清组;Rescue实验,将NP细胞分为对照组、IL-1β组、IL-1β+中药血清组、IL-1β+中药血清+Scriptaid组,采用流式细胞术检测NP细胞的周期和凋亡,蛋白质印迹法(WB)检测p38 MAPK、p-p38 MAPK、HDAC4、增殖细胞核抗原(PCNA)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6、Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ)、基质金属蛋白酶(MMP)-3、含凝血酶敏感蛋白基序的解整合素金属蛋白酶(ADAMTS)-5蛋白表达,RT-PCR检测TNF-α、IL-6、MMP-3、ADAMTS-5mRNA的表达,免疫荧光法检测ColⅡ和PCNA的荧光表达。结果:IL-1β激活p38 MAPK会降低HDAC4、CollagenⅡ和PCNA蛋白表达(P<0.01),上调TNF-α、IL-6、MMP-3和ADAMTS-5 mRNA及蛋白表达水平(P<0.01),延迟更多细胞在G0/G1期(P<0.01);然而独活寄生汤含药血清上调HDAC4、ColⅡ和PCNA蛋白表达(P<0.01),降低TNF-α、IL-6、MMP-3和ADAMTS-5 mRNA及蛋白表达水平(P<0.01),诱导细胞进入S期(P<0.01);而Rescue实验阻断HDAC4的表达ColⅡ和PCNA免疫荧光表达再次降低(P<0.01),TNF-α、IL-6、MMP-3和ADAMTS-5 mRNA表达再次升高(P<0.05),S期细胞再次减少(P<0.01)。结论:独活寄生汤含药血清可通过促进NP细胞增殖和p38 MAPK/HDAC4抑制炎症通路,预防NP细胞凋亡。