诱导胰岛β细胞中铜死亡:靶向SLC39A14调控同型半胱氨酸的作用OA

背景:高同型半胱氨酸血症与胰岛β细胞功能障碍以及抵抗有着密切关系,但其具体分子机制还有待研究。目的:探讨piR-000699靶向调控SLC39A14影响同型半胱氨酸诱导胰岛β细胞铜死亡的潜在机制。方法:体外培养小鼠胰岛β细胞株Min6,将其分为对照组(0μmol/L同型半胱氨酸)和同型半胱氨酸组(分别加入40,80,100及120μmol/L同型半胱氨酸),筛选出100μmol/L的同型半胱氨酸为干预胰岛β细胞的最佳剂量。采用qRT-PCR检测同型半胱氨酸中piR-000699本底表达;Western blot检测同型半胱氨酸诱导胰岛β细胞中铜死亡相关蛋白FDX1、HSP70及piR-000699下游靶基因SLC39A14的表达;铜离子试剂盒测定胰岛β细胞内Cu^(2+)水平。细胞转染分组:①对照组、同型半胱氨酸组(100μmol/L)、同型半胱氨酸+mimics-NC组、同型半胱氨酸+piR-000699 mimics组;②对照组、同型半胱氨酸组(100μmol/L同型半胱氨酸)、同型半胱氨酸+inhibitor-NC组、同型半胱氨酸+piR-000699 inhibitor组。采用qRT-PCR检测转染piR-000699 inhibitor及piR-000699 mimics后细胞piR-000699的mRNA表达;Western blot检测转染piR-000699 inhibitor及piR-000699 mimics后细胞FDX1、HSP70及SLC39A14蛋白的表达;铜离子试剂盒测定转染后细胞Cu^(2+)表达水平。并构建SLC39A14的野生型和突变型双荧光素酶基因载体,验证piR-000699和SLC39A14之间的靶向结合关系。结果与结论:①同型半胱氨酸诱导胰岛β细胞损伤的最佳浓度为100μmol/L;②与对照组相比,同型半胱氨酸组中piR-000699 mRNA表达增高(P<0.01),铜死亡相关蛋白FDX1、HSP70及Cu^(2+)表达均增高(P<0.001);③胰岛β细胞中干扰piR-000699后,同型半胱氨酸进一步下调FDX1、HSP70及SLC39A14蛋白水平(P<0.01),细胞中Cu^(2+)表达水平降低(P<0.01);④胰岛β细胞过表达piR-000699后,同型半胱氨酸进一步上调了细胞中FDX1、HSP70及SLC39A14蛋白水平(P<0.01),细胞中Cu^(2+)水平明显增高(P<0.001);⑤双荧光素酶结合报告实验提示:与mimics-NC比较,转染SLC39A14野生型质粒的胰岛β细胞中同时转染piR-000699 mimics后,其相对荧光素酶活性明显升高(P<0.01)。结论:此次实验结果发现在同型半胱氨酸诱导胰岛细胞铜死亡过程中piR-000699可以通过靶向SLC39A14基因调控细胞铜死亡相关蛋白表达,研究为糖尿病的治疗和预防提供新的靶点和策略。