小分子化合物组合阶段性诱导人脂肪源性干细胞向运动神经元样细胞分化OA

背景:以人脂肪源性干细胞为基础的细胞疗法为神经疾病带来了希望,然而,建立一套高效、稳定且无需基因修饰的定向分化方案仍是临床应用的主要障碍。目的:旨在建立一种两阶段、化学定义的小分子化合物组合策略,以实现脂肪源性干细胞向运动神经元样细胞分化,为神经系统疾病的细胞治疗提供潜在的细胞来源。方法:从脂肪组织中分离、培养并鉴定脂肪源性干细胞。采用两阶段小分子化合物组合诱导方案:第一阶段,采用Dorsomorphin(骨形态发生蛋白抑制剂)、CHIR99021(Wnt激动剂)和SB431542(转化生长因子β抑制剂)组合诱导脂肪源性干细胞向神经祖细胞转分化;第二阶段,获得的神经祖细胞在CHIR99021、维甲酸和Purmorphamine(Shh信号通路特异性激活剂)作用下向运动神经元样细胞分化。通过形态学观察、免疫荧光染色、Western blot和RT-qPCR动态检测神经祖细胞标志物(PAX6、SOX1)和运动神经元标志物(微管蛋白β3、ISL1、HB9、胆碱乙酰转移酶)的表达。结果与结论:第一阶段诱导4 d后,细胞形成了典型的神经花瓣状结构,PAX6和SOX1的蛋白与mRNA表达水平均显著上调(P<0.001),阳性细胞率分别达到85.33%和83.12%,表明人脂肪源性干细胞转分化为神经祖细胞。第二阶段诱导12 d后,细胞呈现典型的运动神经元形态,微管蛋白β3、ISL1、HB9、胆碱乙酰转移酶的表达显著上调(P<0.001),免疫荧光双染78.56%的细胞共表达微管蛋白β3/ISL1,75.04%的细胞共表达HB9/胆碱乙酰转移酶,证实神经祖细胞分化为运动神经元样细胞。综上,通过模拟体内神经发育信号(第一阶段抑制骨形态发生蛋白/转化生长因子β通路并激活Wnt通路,第二阶段激活Wnt/Shh/维甲酸通路),两阶段小分子化合物组合策略能特异性地诱导人脂肪源性干细胞分化为运动神经元样细胞,为神经系统疾病的细胞疗法提供了一种具有重要临床转化潜力的细胞来源。